急性髓系白血病FLT3-ITD基因突變分析*

陳 姣，王曉冬，賈永前

(1四川省人民醫(yī)院血液科， 四川 成都 610072； 2四川大學華西醫(yī)院血液科， 四川 成都 610041)

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia，AML)是臨床上常見的疾病，具有發(fā)病率高、死亡率高和治愈率低等特點，而基因突變是AML發(fā)生、發(fā)展的重要遺傳性特性[1]。AML發(fā)病機制復(fù)雜，多發(fā)生在青壯年人群中，成為35歲以下人群腫瘤致死的重要因素。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，通過規(guī)范的聯(lián)合化療、干細胞移植及生物治療能治愈30.0%～50.0%的患者，但是仍有30.0%患者治療預(yù)后較差，生存期僅為3～6個月[2]。文獻報道顯示[3]，急性髓系白血病的發(fā)生、發(fā)展是一個多因素過程，而酪氨酸激酶受體通路在其中發(fā)揮重要作用。研究表明[4]，酪氨酸激酶受體通路幾乎存在于所有生長增殖過程中，能促進細胞的分化。FMS樣酪氨酸激酶3(FMS-like tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3)是一種刺激性生長因子受體，主要在正常骨髓CD34+造血干/祖細胞中表達，被視為是潛在的引起白血病的原癌基因。FLT3突變影響正常造血細胞功能，與疾病的發(fā)生、發(fā)展均具有緊密的聯(lián)系[5]。因此，本課題以2015年3月～2017年6月自愿到科室接受治療的207例初發(fā)急性髓系白血病患者作為研究對象，采用PCR法完成上述病例骨髓標本的FLT3-ITD基因的檢測，采用染色體R顯帶技術(shù)完成核型分析，并結(jié)合臨床資料、隨訪及預(yù)后等進行分析，探討初發(fā)急性髓系白血病患者FLT3-ITD基因突變情況，報道如下。

材 料 和 方 法

1 病例選擇及一般資料

選擇2015年3月1日～2017年6月1日于四川省人民醫(yī)院血液科收治的初發(fā)急性髓系白血病患者207例，其中男121例，女86例，年齡(19～82)歲，平均(46.74±3.51)歲，中位年齡(44.00±2.10)歲。根據(jù)1976年FAB標準及2016年WHO標準分級：M0 43例，M1 40例，M2 45例，M3 29例，M4 26例、M5 10例、M6 14例及M7 0例。本課題得到醫(yī)院倫理委員會同意，患者及家屬對治療方案具備知情權(quán)。

納入標準：(1)符合急性髓系白血病臨床診斷標準[6]；(2)所有患者均經(jīng)過骨髓細胞形態(tài)學、免疫表型、染色體及融合基因檢測最終得到確診；(3)符合FAB及WHO相關(guān)標準者。排除標準：(1)難以嚴格遵循醫(yī)囑完成相關(guān)檢查、治療者；(2)合并嚴重心、肝和腎功能異常及伴有明顯精神異常者。

2 方法

2.1PCR法對骨髓標本的FLT3-ITD基因突變的檢測 入組患者入院次日早晨空腹抽取骨髓標本5 mL，分離血清后采用DNA抽提試劑盒提取血細胞的DNA，紫外分光光度計確定其含量及純度。根據(jù)急性髓系白血病特點并參考有關(guān)文獻獲得FLT3-ITD基因全序列并設(shè)計相關(guān)引物。針對基因的編碼區(qū)完成引物的設(shè)計，將引物的長度控制在22 bp，設(shè)置退火溫度為59 ℃，濃度0.2 μmol/L。取20 μL反應(yīng)體系[7]，該體系中包括 10 μL 2×GoTaq Green Master Mix、1 μL 上、下游引物、2 μL DNA和6 μL H2O。FLT3-ITD基因上、下游引物見圖1。

Figure 1. The primer sequences for determining the mutation ofFLT3-ITDgene by PCR.

圖1檢測FLT3-ITD基因突變的PCR上、下游引物序列

根據(jù)整個系統(tǒng)體系設(shè)置反應(yīng)條件為95 ℃ 15 min；95 ℃ 30 s、59 ℃ 50 s、72 ℃ 60 s，連續(xù)進行29個循環(huán)；72 ℃ 7 min。采用含Gold View核酸染色劑在濃度為2%瓊脂糖凝膠下進行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，利用Tanon MP軟件獲取感興趣區(qū)域圖像。

2.2R顯帶核型分析 將采集的骨髓標本放置在肝素中進行抗凝，取細胞注入培養(yǎng)瓶中連續(xù)進行36～40 h培養(yǎng)，獲得相應(yīng)染色體后制片，顯帶，每份標本自動挑選出20個分裂相對清晰的核型。

2.3治療方法 對于初發(fā)的AML患者均采用蒽環(huán)類聯(lián)合阿糖胞苷完成誘導，對于M3患者則采用全反式維甲酸或砷劑進行治療，連續(xù)治療6～8個療程[8]。

3 統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

1 急性髓系白血病FLT3-ITD基因突變情況

207例AML患者的標本中42例存在FLT3-ITD基因突變，陽性率為20.29%。第1泳道顯示FLT3-ITD陽性患者中有3條顯示帶，1條位于300 bp，1條位于400 bp，1條位于500 bp，見圖2。

42例FLT3-ITD基因突變陽性患者結(jié)果表明FLT3-ITD基因突變多依次從首尾相接，并且其中插入多個核苷酸，但是所有的突變均為框內(nèi)突變，見圖3。

2 42例FLT3-ITD陽性患者FAB標準及WHO標準分級

根據(jù)FAB標準及WHO標準分級，42例FLT3-ITD陽性患者中M0占0.00%，M1占2.38%(1/42)、M2占23.81%(10/42)、M3占0.00%、M4占2.38%(1/42)、M5占69.05%(29/42)、M6占0.00%、M7占2.38%(1/42)。

Figure 2. The image of PCR product for determining the mutations ofFLT3-ITDgene (The detection of each sample repeated 4 times).

圖2急性髓系白血病FLT3-ITD基因突變情況

Figure 3. The result of DNA sequencing indicated the positive FLT3-ITD mutation (the black arrow pointed the mutation site, and the red arrow pointed the normal site).

圖3FLT3-ITD陽性標本測序測定

表2 FLT3-ITD陽性患者與陰性患者臨床資料、隨訪及預(yù)后情況比較Table 2. The clinical data and the information of FLT3-ITD positive and FLT3-ITD negative AML patients (Mean±SD)

3 FLT3-ITD陽性患者與陰性患者臨床資料、隨訪及預(yù)后情況比較

FLT3-ITD陽性患者與陰性患者的骨髓爆炸率比較差異無統(tǒng)計學顯著性；FLT3-ITD陽性患者的WBC水平和CR率均低于FLT3-ITD陰性患者(P<0.05)，見表2。

討 論

急性髓系白血病是臨床上常見的疾病，是起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，發(fā)病早期臨床癥狀顯著，具有高度異質(zhì)性。文獻報道顯示[9]白血病患者染色體核型是白血病患者預(yù)后的重要的標記，盡管初治治療緩解率已經(jīng)達到70.0%以上，但是仍然有30.0%患者生存率較低，因此，加強急性髓系白血病患者早期診斷、治療對改善患者預(yù)后具有重要的意義[10]。

急性髓系白血病發(fā)病機制復(fù)雜，且相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)FLT3-ITD基因突變是AML中最為常見的突變之一，是引起酪氨酸激酶異?；罨?、細胞因子非依賴性細胞增殖的重要原因，其水平高低與白血病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[11]。本研究中，207例AML患者的標本中42例存在FLT3-ITD基因突變，陽性率為20.29%。FLT3-ITD陽性患者中有3條顯示帶。42例FLT3-ITD基因突變陽性患者結(jié)果表明，F(xiàn)LT3-ITD基因突變多依次首尾相接，并且其中插入多個核苷酸，但是所有的突變均為框內(nèi)突變。FLT3-ITD基因突變是AML患者中最為常見的基因突變，在AML的發(fā)生、預(yù)后中發(fā)揮了重要的作用，對其進行檢測不僅是為了研究白血病的發(fā)病機制，更重要的是為了對臨床治療提出指導建議[12]。從大的角度來說，F(xiàn)LT3屬于III類酪氨酸激酶受體的一種，III類酪氨酸激酶受體主要包括：PDGF-R、KIT、FMS 3種，均在造血祖細胞早期增殖、分化的起始階段發(fā)揮了重要的作用。而人FLT3-ITD基因主要位于染色體13q12，共含有24個外顯子。文獻報道顯示[13]，F(xiàn)LT3-ITD基因突變是急性髓系白血病患者中最為常見的突變，可出現(xiàn)在20.0%～30.0%患者中，其突變將會造成正常血細胞發(fā)生增殖、分化及凋亡。FLT3-ITD基因突變從大的角度主要有2種，一種是在細胞膜內(nèi)近膜區(qū)內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)的突變，另一種是酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的點突變，而后者更多地發(fā)生在835號密碼子上。臨床上，通過對FLT3-ITD基因突變進行分析能更加清晰了解白血病的發(fā)生、發(fā)展情況，能為白血病的治療提供依據(jù)和參考。

目前，臨床上對于急性髓系白血病的治療方法相對較多，包括全反式維甲酸和三氧化二砷等，不同的治療方法在急性髓系白血病患者的治療中均發(fā)揮了重要的作用。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，靶向治療在急性髓系白血病患者中得到應(yīng)用，且效果理想。靶向治療的關(guān)鍵在于尋找特異性的基因位點或蛋白位點。對白血病的細胞遺傳學和分子生物學的研究發(fā)現(xiàn)，白血病的預(yù)后與特征性的染色體和基因改變密切相關(guān)[14]。目前，臨床上確定的有關(guān)急性髓系白血病突變的基因包括PML-RARα、AML1-MTG8、CBFβ-MYH11、NPM1和FLT3-ITD等，不同的基因在疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了不同的作用。文獻報道顯示，F(xiàn)LT3-ITD基因突變在急性髓系白血病預(yù)后中具有良好的預(yù)測作用。本研究中，F(xiàn)LT3-ITD陽性患者與陰性患者骨髓爆炸率比較差異無統(tǒng)計學顯著性；FLT3-ITD陽性患者的WBC水平和CR率均低于FLT3-ITD陰性患者。由此看出FLT3-ITD基因突變在急性髓系白血病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用，加強患者FLT3-ITD基因測定能了解患者預(yù)后，能根據(jù)檢測結(jié)果正確地指導臨床治療。但是，目前臨床上對于FLT3-ITD基因突變的研究尚處于初期階段，對于FLT3-ITD基因突變在急性髓系白血病患者中的評估、預(yù)后等缺乏統(tǒng)一的標準，均需要更大的樣本進行研究。

綜上所述，F(xiàn)LT3-ITD基因突變檢測陽性患者WBC水平、CR率低于陰性患者，能作為臨床危險因素，利于AML患者預(yù)后的判斷，有助于指導臨床治療。

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