小檗堿增強(qiáng)絲裂霉素C誘導(dǎo)的膀胱癌T24細(xì)胞周期阻滯及凋亡*

秦曉平，詹雄宇，陳奇彪，黃保元，黃 君，卓育敏△

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1泌尿外科， 2超聲科， 廣東 廣州 510632)

膀胱癌在發(fā)達(dá)工業(yè)國家是最常見的泌尿外科惡性腫瘤之一,其在臨床上主要分為兩大類型，一是非肌層浸潤性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)；二是肌層浸潤性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)，其中NMIBC發(fā)病率占所有膀胱癌的70%～80%[1]。經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)(transurethral resection of bladder tumor, TURBT)和術(shù)后輔助性膀胱灌注治療[2-3]是治療 NMIBC的標(biāo)準(zhǔn)療法。臨床研究顯示膀胱灌注絲裂霉素C (mitomycin C, MMC；又稱自力霉素)，可以有效地預(yù)防低危淺表性膀胱癌的復(fù)發(fā)[4]。國內(nèi)也有相關(guān)研究報(bào)道[5]，應(yīng)用絲裂霉素灌注膀胱治療58例淺表性膀胱癌患者并取得較好的療效。雖然MMC作為一種擁有確切治療效果的膀胱灌注化療藥物，并已廣泛應(yīng)用到臨床各類型腫瘤的術(shù)后輔助化療中，但是它的不良反應(yīng)仍限制了它在治療膀胱癌中的應(yīng)用。所以，尋找一種對治療膀胱癌具有更高療效，又能通過降低MMC灌注劑量從而減少對正常細(xì)胞損傷的治療方法，具有十分重要的臨床意義。

小檗堿(berberine，Ber)作為一種天然的異喹啉類生物堿，是從黃連屬草本植物中分離的，具有多種藥理及生物學(xué)活性，包括抗腫瘤，降血脂，抗微生物和抗炎等[6-9]，其抗腫瘤作用已成為近年來研究的熱點(diǎn)。大量的研究表明，小檗堿對骨髓、肝、肺、胃腸道、膀胱和前列腺等類型腫瘤細(xì)胞的生長具有抑制作用[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，小檗堿的抗腫瘤的特性與其抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，引起細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞遷移的抑制有關(guān)[10-11]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，Ber (1 μmol/L)能增強(qiáng)表阿霉素和阿霉素誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，從而增強(qiáng)其對膀胱癌細(xì)胞的抗增殖作用，其機(jī)制可能與內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路激活有關(guān)[12-14]。然而小檗堿聯(lián)合絲裂霉素對膀胱癌細(xì)胞是否有影響？目前尚缺乏深入研究。因此，本文觀察小檗堿聯(lián)合絲裂霉素C對膀胱癌細(xì)胞T24的細(xì)胞周期及凋亡的影響，并探討潛在的作用機(jī)制。對尋找一種對治療膀胱癌有更高療效，又能減少其副作用的治療方法，具有十分重要的臨床意義。

材 料 和 方 法

1 主要材料

人類膀胱癌T24細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院(目錄編號(hào)：TCHu55)。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶和雙抗(青霉素和鏈霉素)均購自HyClone；細(xì)胞增殖活性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)購自Dojindo；中性硫酸小檗堿購自Sigma；注射用絲裂霉素(每支2 mg)購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司；本研究中所使用的所有抗體均購自Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1T24細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞采用含10% FBS和10% 雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。將T24細(xì)胞分為4組：對照(control)組、MMC組、MMC聯(lián)合Ber(MMC+Ber)組和Ber組。

2.2CCK-8法檢測T24細(xì)胞活力 以每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板觀察細(xì)胞的生長情況。分別加入不同劑量的小檗堿(0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和2.0 μmol/L)和/或絲裂霉素(150 μmol/L)，設(shè)置空白對照(control,Ctrl)組。分別培養(yǎng)24 h和48 h后，每孔加入10 μL CCK-8檢測試劑，置于培養(yǎng)箱匯總繼續(xù)培養(yǎng)30 min。隨后用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度(A)，以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。細(xì)胞活力(%)=實(shí)驗(yàn)組A值/對照組A值×100%。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期分布 將T24細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h,后按分組對其進(jìn)行加藥，24 h后收集細(xì)胞，1 500 r/min離心5 min，再用PBS洗滌細(xì)胞1次。每管500 μL 70%乙醇重懸細(xì)胞，放置-20 ℃ 固定過夜。第2天染色前，用PBS洗去乙醇，1 500 r/min離心5 min，加入5 μL RNase A，37 ℃ 水浴30 min，再加入10 μL PI染色液，充分混勻后于室溫下避光孵育15 min后即可用流式細(xì)胞儀檢測。

2.4Western blot 檢測蛋白表達(dá) 將T24細(xì)胞以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h后對其進(jìn)行加藥，24 h后獲得細(xì)胞沉淀。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入150 μL含PMSF的RIPA裂解液，吹打混勻后置于冰上裂解30 min，每隔10 min 用細(xì)胞刮刀刮1次細(xì)胞，讓RIPA裂解液與細(xì)胞充分混勻，收集上述混合液于EP管中，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，吸取上清，BCA蛋白定量測定試劑盒(碧云天)進(jìn)行蛋白定量。以12% SDS-PAGE分離，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后取出PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。根據(jù)marker位置切取目的條帶，分別加入相應(yīng)的Ⅰ抗于4 ℃孵育過夜。第2天，加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h。在膜上滴加ECL發(fā)光液，X線底片曝光，GAPDH作為內(nèi)參照。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5Annexin V-FITC/PI 雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 每孔以1×106個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后對其進(jìn)行加藥處理，24 h后收集細(xì)胞，包括漂浮在培養(yǎng)基上的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL Binding Buffer，重懸混勻后，加入5 μL Annexin V-FITC，室溫下避光孵育10 min染色，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入200 μL Binding Buffer 充分重懸混勻后，加入5 μL PI染色，上機(jī)檢測各組細(xì)胞的凋亡率。上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間均數(shù)兩兩比較采用Bonferroni法檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 CCK-8法檢測T24細(xì)胞活力

不同濃度(0.5 μmol/L、1.0 μmol/L和2.0 μmol/L)的Ber協(xié)同MMC(150 μmol/L) 分別處理T24細(xì)胞24 h和48 h后，用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，結(jié)果提示,處理48 h后，MMC+Ber組較MMC組對T24細(xì)胞活力的抑制效果更明顯(P<0.05)，見圖1。

Figure 1. The viability of T24 cells treated with MMC and Ber for 24 h and 48 h. Mean±SEM.n=3;*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsMMC group.

圖1Ber聯(lián)合MMC對T24細(xì)胞活力的影響

2 流式細(xì)胞儀檢測T24細(xì)胞周期結(jié)果

如圖2所示，加藥處理T24細(xì)胞24 h后，MMC+Ber組較MMC組有更多細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并且T24細(xì)胞在S期細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.05),見圖2。

Figure 2. Effects of MMC and Ber on cell cycle in T24 cells. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

圖2Ber聯(lián)合MMC對T24細(xì)胞周期的影響

3 Ber對MMC處理后的T24細(xì)胞p21、p27、CDK2、CDK4、cyclin D1和survivin蛋白表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與MMC組相比，MMC+Ber組能上調(diào)p21和p27蛋白的表達(dá)(P<0.05)，并且能下調(diào)cyclinD1、CDK2、CDK4以及survivin蛋白的表達(dá)(P<0.05)，見圖 3、4。

Figure 3. Effects of Ber on p21 and p27 protein levels in MMC-treated T24 cells. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

圖3Ber對MMC誘導(dǎo)的T24細(xì)胞p21和p27蛋白表達(dá)的影響

Figure 4. Effects of Ber on the protein expression of CDK2, CDK4, cyclin D1 and survivin in T24 cells treated with MMC for 24 h. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

圖4Ber對MMC誘導(dǎo)的T24細(xì)胞cyclinD1、CDK2、CDK4和survivin蛋白表達(dá)的影響

4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡的結(jié)果顯示,MMC+Ber 組細(xì)胞凋亡率明顯高于MMC組(P<0.05)，以上結(jié)果表明Ber能促進(jìn)MMC誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡,見圖5。

討 論

TURBT是目前治療NMIBC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法， 然而術(shù)后仍有較高的腫瘤復(fù)發(fā)率，所以，術(shù)后行膀胱輔助灌注化療或者免疫治療已成為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和進(jìn)展的重要手段之一。目前臨床上膀胱灌注化療及免疫治療藥物的種類較多，常用的有蒽環(huán)類藥物[15-17]。MMC是臨床上較為常用的膀胱癌術(shù)后化療藥物之一。近年來，術(shù)后灌注MMC對控制腫瘤復(fù)發(fā)得到了證實(shí)。但長期高劑量的使用會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)血尿、尿頻和尿急等刺激癥狀從而導(dǎo)致膀胱儲(chǔ)尿時(shí)間變短，甚至?xí)绊懰幬镏委煹臅r(shí)間，影響治療效果。同時(shí)蒽環(huán)類藥物的心臟毒副作用亦限制了其在臨床上的應(yīng)用。同時(shí)Lv等[18]報(bào)道小檗堿能抑制阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)小檗堿能通過抑制ROS的產(chǎn)生，抑制H2O2誘導(dǎo)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞凋亡。綜上所述，小檗堿一方面能抑制腫瘤細(xì)胞生長，另一方面它能保護(hù)正常體細(xì)胞。如果將Ber和MMC聯(lián)合用藥能否起到增強(qiáng)對膀胱癌的療效，同時(shí)又減輕絲裂霉素的毒副作用？目前尚缺乏相關(guān)研究。

Figure 5. The effects of Ber on the apoptosis of MMC-induced T24 cells detected by flow cytometry. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vscontrol (Ctrl) group;#P<0.05vsMMC group.

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測Ber聯(lián)合MMC誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡率

本課題組前期用CCK-8法檢測藥物處理后的T24 細(xì)胞，結(jié)果表明Ber能增強(qiáng)MMC抑制T24細(xì)胞的增殖能力。腫瘤細(xì)胞的生長以及分化必須要求細(xì)胞分裂具有嚴(yán)格的精確性和定時(shí)性，而細(xì)胞周期有著嚴(yán)格的順序，即從G1→S→G2→M，這其中有若干重要關(guān)卡，其中G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換是其中最重要的2個(gè)關(guān)卡之一，前者稱作啟動(dòng)點(diǎn)，或者限制點(diǎn)。為了進(jìn)一步揭示Ber增強(qiáng)MMC抑制T24細(xì)胞增殖的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)檢測了細(xì)胞周期及調(diào)控細(xì)胞周期的相關(guān)蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Ber+MMC組G0/G1期細(xì)胞比例較Ber組和MMC組增高，S期細(xì)胞比例降低，表明Ber能夠促進(jìn)MMC引起T24的細(xì)胞周期阻滯。目前認(rèn)為p21和p27是重要的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑，它們能結(jié)合絕大部分的cyclin-CDK復(fù)合物，從而抑制其活性，起到調(diào)控細(xì)胞周期的作用[20-22]。因此我們測定了p21和p27以及其下游的周期調(diào)控相關(guān)蛋白cyclin D1、CDK2和CDK4蛋白的表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ber顯著上調(diào)p21和p27的表達(dá)(P<0.05)，抑制CDK-2、CDK-4和cyclin D1的表達(dá)(P<0.05)。這提示Ber能夠促進(jìn)MMC加強(qiáng)對膀胱癌T24細(xì)胞周期抑制作用，其主要機(jī)制可能是通過上調(diào)p21和p27，進(jìn)而導(dǎo)致CDK和cyclin D1相關(guān)周期蛋白的表達(dá)減少，阻斷細(xì)胞從G1期向S期進(jìn)展從而使細(xì)胞周期停滯在G1/G0期。Survivin在各種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，它不僅能調(diào)控細(xì)胞周期，且具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。同時(shí)survivin近年來被認(rèn)為是膀胱癌診斷和預(yù)后的一個(gè)有價(jià)值的指標(biāo)。它是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis，IAP)家族中最小的成員，不僅具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，還能調(diào)控細(xì)胞周期。Western blot結(jié)果顯示，Ber+MMC處理T24細(xì)胞后其survivin蛋白表達(dá)水平較單用MMC和control組均亦顯著下降，Ber能增強(qiáng)MMC誘導(dǎo)膀胱癌T24細(xì)胞凋亡。

Ber應(yīng)用歷史悠久，價(jià)格便宜，且研究表明它對正常體細(xì)胞具有保護(hù)作用，如能利用其優(yōu)勢開發(fā)新的化療藥劑，并進(jìn)行相關(guān)研究，這將為治療膀胱癌提供了新的策略和思路。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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