新型PD模型研究進展

東惟玲 方琪 單立冬

帕金森病(Parkinson disease，PD)多見于老年人，平均發(fā)病年齡為55歲，70歲及以上人群發(fā)病率達120/10萬。臨床上以靜止性震顫、運動遲緩、肌肉強直和步態(tài)障礙為主要特征。其病理學特點包括黑質紋狀體多巴胺(dopamine，DA)能神經元缺失和胞質內路易小體(Lewy bodies，LB)的形成。自從1817年由英國醫(yī)生Parkinson首次提出至今已被廣泛研究了近兩個世紀，但PD的病因學和發(fā)病機制仍然不是很清楚。既往研究表明，PD是遺傳和環(huán)境因素相互作用的結果[1]，是多種因素導致的疾病。

PD動物模型一般可分為兩種：一種是利用生活中存在的或者半合成的神經毒素造模，另一種是利用PD相關基因產生突變造模。神經毒素模型又包括可逆性和不可逆性兩種，最近幾年的研究焦點均放在了藥物引起的不可逆性的PD模型病理和癥狀表現(xiàn)的研究上。6-羥基多巴胺(6-hydroxydopa，6-OHDA)和1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)是使用最廣泛的神經毒素，魚藤酮是最新發(fā)現(xiàn)的用于PD造模的穩(wěn)定的神經毒素。所有神經毒素造模的共同特點是產生氧化應激，進而引起DA能神經元細胞的死亡。PD相關基因(如α-synuclein、parkin、LRKK2、PINK1、DJ-1等)的發(fā)現(xiàn)加深了對PD的了解。盡管絕大部分的PD是散發(fā)性的，但是家族性和散發(fā)性PD的主要發(fā)病機制、對左旋多巴反應的一致性以及相似的發(fā)病形式，都表明二者具有相同的引起神經退行性變的最終通路。因此基因模型在揭示PD中DA能神經元死亡的分子機制和發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點方面有著非常重要的意義。

1 魚藤酮PD模型

魚藤酮是從熱帶植物中提取的化合物，它是魚藤酮類化合物中作用最強的神經毒素，半衰期依曝光時間而定，大約3～5 d。魚藤酮同MPTP一樣具有很高的脂溶性，很容易通過血-腦脊液屏障和生物膜，而且不需要DA轉運體的轉運。它可以選擇性地破壞DA能神經元[2]，減少酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)陽性細胞數，導致PD癥狀的出現(xiàn)[3]。自2000年魚藤酮被首次提出以來，引起廣泛關注，其被注意的原因主要有兩個：一是流行病學研究結果顯示有機農藥和農村偶發(fā)PD發(fā)病率高有密切關系；二是魚藤酮復制了PD患者大多數的運動癥狀和組織病理特點，尤其是LB的形成。

1.1作用機制關于魚藤酮造模機制有很多不同的看法。作為氧化呼吸鏈抑制劑，魚藤酮被認為是抑制線粒體氧化呼吸鏈復合體I的氧化磷酸化，使ATP減少導致細胞能量不足而死亡。然而Sanders等[4]研究認為魚藤酮導致DA能神經元退行性丟失的最初機制是氧化損傷而非ATP的減少：魚藤酮與復合體I結合，減少電子向泛醌的流動，因而產生更多的自由電子與氧分子結合為氧負離子，進而導致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生，損壞復合體I本身和呼吸鏈的其他成分；ROS還可以損害線粒體的其他蛋白和大分子物質。 Cicchetti等[5]認為魚藤酮抑制線粒體復合體I的電子從鐵硫中心向泛醌轉運，生成的大量ROS超出了DA能神經元自身的抗氧化清除能力，引起細胞的損傷。魚藤酮還可以引起細胞內半胱天冬酶的活化，進而引起細胞凋亡[6]。很多學者更傾向于魚藤酮引起的細胞損傷是多種途徑的，多方面因素共同導致細胞死亡。

1.2造模方法到目前為止，魚藤酮建立模型的方法主要有全身性的系統(tǒng)給藥和腦內定位注射。

1.2.1全身性系統(tǒng)給藥：又包括口服、靜脈給藥、皮下注射和腹腔注射?？诜饦O少的神經毒性；使用滲透泵慢性全身注射是最常見的處理方法；腹腔注射可引起行為障礙和神經生化方面的缺損，但死亡率很高；靜脈注射可以引起黑質紋狀體DA能神經元的損傷，同時伴隨著α-突觸核蛋白聚集、LB形成、氧化應激和胃腸道問題。

1.2.2腦內定位注射：常見的腦內注射部位有紋狀體、黑質致密部(substantia nigra pars compacta,SNpc)、內側前腦束(median forebrain bundle,MFB)和丘腦的腹側被蓋區(qū)(ventral tegmental area,VTA)。因注射部位不同可引起不同的反應。研究表明，向大鼠腦部的紋狀體(12 μg/只)、SNpc(6 μg /只)和MFB(12 μg/只)分別注射魚藤酮，結果引起紋狀體的DA含量明顯減少，與對照組相比依次減少30%，62%，96%[7]。在Sindhu等[8]的實驗中，向SNpc和MFB注射魚藤酮(12 μg/只)，第32天經高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)分析發(fā)現(xiàn)都可以引起DA明顯減少，SNpc注射減少超過80%，而MFB超過95%。由此可見MFB對魚藤酮更為敏感。行為學和神經生物化學結果顯示，魚藤酮引起的MFB損傷動物模型最接近6-OHDA引的起黑質損害[9]。但要達到紋狀體DA減少80%只需要魚藤酮2.5 μg/只，而6-OHDA則需要6～8 μg/只[10]，表明魚藤酮更有潛力。

腦內注射部位不同引起的行為學表現(xiàn)也不完全相同。向SNpc注射魚藤酮，大鼠在麻醉蘇醒后立即出現(xiàn)向注射部位對側旋轉，這一行為將持續(xù)1 d多，然后慢慢消失，至第3天完全消失[8]，而向紋狀體和MFB注射不會出現(xiàn)這種自發(fā)的旋轉行為。藥物誘導的旋轉實驗周期和旋轉的方向也不相同：向大鼠紋狀體和SNpc注射魚藤酮，14～16 d后即可用阿撲嗎啡誘導旋轉檢測模型是否成功，而向MFB注射需到28～30 d才會出現(xiàn)明顯的旋轉行為，這對快速鑒定是否造模成功不利，但是MFB體積大、對魚藤酮敏感等優(yōu)點使其應用較多。另外，阿撲嗎啡引起的旋轉方向不完全相同：MFB注射組大鼠向對側旋轉而紋狀體組和SNpc組大鼠向同側旋轉。向VTA注射魚藤酮引起中腦邊緣的DA缺失，與PD模型的非運動癥狀有關。

1.3局限性魚藤酮建立的PD模型可以引起注射同側腦內的TH+神經元缺失，可以復制大多數的PD患者的運動癥狀和病理組織特點改變，尤其是 LB的形成[11]，但這種模型會引起大腦的非特異性的損傷和外周器官的毒性。Xiong等[12]認為PD大鼠模型主要出現(xiàn)肝小葉中央靜脈斷裂、腎小球和間質紅細胞增多、肺泡壁變薄易破和中性分泌物出現(xiàn)、脾臟大出血等，而對心臟和胃影響較小。相反，Ravenstijn等[13]研究認為皮下注射魚藤酮引起的全身毒性以心臟和胃最為突出。 Binienda等[14]在2013年首次報道了慢性魚藤酮處理與外周神經病理損害有關。在Norazit等[15]的實驗中，注入黑質紋狀體系統(tǒng)的所有濃度的魚藤酮均會引起紋狀體周圍組織的損傷和壞死，即使0.5 μg的低劑量也會引起自身生理和炎性反應損害。Klein等[16]的實驗結果顯示，對照組和實驗組均會出現(xiàn)超出黑質邊緣區(qū)域的宏觀損傷。

同其他的神經毒素一樣，魚藤酮造模除引起上述的非特性損傷外，還存在實驗方面缺陷：首先，它不能準確地概括涉及中樞神經系統(tǒng)多個區(qū)域的漸進性的病變過程；另外該造模的急性特點，把正常情況下需要幾十年的退行性病變過程加速到動物生命的幾天或幾年內完成。

2 基因模型

盡管神經毒素模型對PD的研究提供了很大幫助，但是它們不能很準確地闡明漸進性的發(fā)病過程和PD的本質以及在人類中的病理分布。在過去的十幾年中，一些與家族性PD相關基因的發(fā)現(xiàn)，預示著新的PD模型到來，各種各樣的PD相關的哺乳類、非哺乳類的動物模型被創(chuàng)造出來。第一個被公認的PD相關基因是α-synuclein基因，隨后又發(fā)現(xiàn)許多其他的常染色體顯性或隱性形式遺傳的基因，這些基因包括parkin、DJ-1和LRRK2等。最近的研究顯示，編碼葡糖腦苷脂的基因突變也與家族性PD相關[17]。

2.1造模機制基因模型的造模機制主要是根據PD相關基因編碼蛋白的功能來造模，這些蛋白表達的過多或過少可能都會導致PD的發(fā)生。α-synuclein基因是最早發(fā)現(xiàn)的與家族性PD相關的基因。目前，廣泛認為α-synuclein基因的突變，例如堿基的替換(A53T、A30P等)、堿基重復等都與家族性PD的發(fā)病相關。α-synuclein是LB的主要成分，這些理論基礎有力地支持了通過使野生型和突變型過表達這種蛋白來造模的說法。α-synuclein作為PD相關基因被發(fā)現(xiàn)不久，即有報道Parkin基因的突變可以通過常染色體隱性遺傳的方式引起青少年PD。一般認為，Parkin是一種與蛋白酶體降解途徑相關的泛素連接酶，這種蛋白的缺失會導致某些底物神經毒素的累積。LRRK2是一種組成很多獨立結構域的大分子量蛋白，其中一個就是表現(xiàn)出GTP依賴性磷酸化激酶的結構域。LRRK2基因突變被認為是最常見的引起PD的基因突變，其中最常見的是G2019S突變，在家族性PD中約占5%～6%，散發(fā)性PD中占1%～3%[18]。

2.2造模方法目前應用較多的造模方法是利用病毒載體介導的轉基因和基因敲除，例如通過短發(fā)卡結構RNA介導基因敲除，干擾內源性基因的表達。這一理論已經通過腺病毒載體(recombinant adeno-associated viral，rAAV)介導的TH基因敲除得到證實，自身短發(fā)卡結構RNA介導的TH基因沉默會導致DA的缺失，進而出現(xiàn)動物的行為異常。在Anvret等[19]的研究中，醇脫氫酶(alcohol dehydrogenases，ADH)基因敲除小鼠模型與同窩出生的正常小鼠相比會引起DA系統(tǒng)相關的行為學改變。Mulcahy等[1]向大鼠單側黑質紋狀體系統(tǒng)注入腺病毒相關的α-synuclein(AAV-α-synuclein)發(fā)現(xiàn)，大鼠紋狀體過表達α-synuclein，并且這個過表達的基因產物可以向軸突末端傳遞，并在胞內聚集引起黑質紋狀體神經元胞體和突起的丟失，引起對側明顯的運動功能損害。為了更加全面地復制PD模型，他將環(huán)境因素(魚藤酮)和遺傳因素(AAV-α-synuchein)結合起來，依次注射AAV-α-synuclein和魚藤酮，先使α-synuclein過表達，再利用神經毒素引起病變。結果顯示單獨注射魚藤酮或AAV-α-synuclein都會引起大鼠運動功能障礙和潛在的黑質紋狀體系統(tǒng)神經元的退化，當二者共同作用時，運動癥狀和黑質紋狀體的缺失比單一因素作用時明顯很多。

基因模型并不只是模擬家族性PD的發(fā)病過程，Mandel等[20]就建立了一種新型的散發(fā)性PD基因模型，方法是利用短發(fā)卡結構RNA的慢病毒載體(recombinant lentiviral，rLV)侵染黑質源性細胞系使泛素連接酶復合體中的必需成分——SKP1A基因敲除，結果SKP1A缺乏會導致細胞死亡的敏感性上升和DA能神經元表型標記物表達的下降。當誘導分化時，SKP1A基因沉默的基因不會停留在G0/G1期，而是進入異常的細胞周期并導致漸進的細胞死亡。

2.3局限性轉基因技術造模耗時較長，過程相對復雜，而且在模型逐漸成長的過程中可能會產生某些基因代償性的表達以及PD相關基因廣泛表達產生的混雜的副作用。病毒載體模型過程簡單而迅速；在成年鼠中進行可以避免相應基因的代償表達；可以將相關基因的表達限制在感興趣的區(qū)域，如黑質，并且可以單側處理兩側比較觀察，避免轉基因技術的缺點。需注意的是，轉基因和基因敲除模型不能引起黑質多巴胺神經元漸進性的缺失，而這正是PD主要的病理變化，故只能模擬疾病早期階段。

綜上所述，神經毒素模型逐漸建立起與人類PD病理特征一致的動物模型，基因學研究揭示了PD的遺傳學機制和發(fā)病特點；神經毒素模型在篩選癥狀治療的藥物方面作用很大，而基因模型在評價基因在PD中的作用很大；神經毒素模型缺點是模擬PD的晚期，對研究疾病的治療產生一定的困難，而基因模型是使用過表達或基因敲除技術模擬疾病早期階段，沒有特征性的DA能神經元的缺失。因此，在PD疾病模型方面還有很多工作要做，力求尋找一個能夠涵蓋PD各種特征、具有相似發(fā)病過程、快速有效且安全的單一的PD模型。

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