不同抗真菌藥物誘導(dǎo)白假絲酵母菌L型的實驗研究

高張晉，王方坤，尹 潔，王 麗，楊雄斌，楊小琴，郭利軍*

（1.大理大學公共衛(wèi)生學院，云南大理 671000；2.大理大學臨床醫(yī)學院，云南大理 671000）

L型菌是一類細胞壁缺失或缺陷的細菌變異株，因1935年在Lister研究院首次被發(fā)現(xiàn)而得名，目前在大多數(shù)細菌、螺旋體和真菌中都發(fā)現(xiàn)L型的存在，L型菌的形成與長期大量使用抗菌藥物有關(guān)〔1〕。一般認為破壞細菌細胞壁合成的抗菌藥物可誘導(dǎo)細菌轉(zhuǎn)變?yōu)長型，但有研究表明，喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星也能誘導(dǎo)出大腸埃希菌和痢疾志賀菌的L型，而喹諾酮類是抑制細菌DNA螺旋酶的抗菌藥物〔2〕，說明不只作用于細胞壁的抗菌藥物能導(dǎo)致L型菌的產(chǎn)生。目前常用抗真菌藥物唑類、多烯類和核苷類都不是作用于真菌細胞壁產(chǎn)生殺菌或抑菌作用。有學者報道，曾從患病者體液中分離出念珠菌的L型，用兩性霉素B、酮康唑、氟康唑等抗真菌藥物可誘導(dǎo)念珠菌和隱球菌細胞壁缺損而形成L型菌〔3-11〕。但國內(nèi)對真菌L型的報道較少，迄今為止尚無對誘導(dǎo)真菌L型形成的藥物劑量、作用時間的研究，L型真菌的形態(tài)改變亦不明確。為此我們擬采用氟康唑、兩性霉素B、氟胞嘧啶作為誘導(dǎo)劑，以期在實驗條件下誘導(dǎo)出白假絲酵母菌L型，探討抗真菌藥物在白假絲酵母菌L型形成過程中可能的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 白假絲酵母菌TCC10231，由大理大學病原生物學綜合實驗室提供。

1.1.2 藥物 氟康唑（fluconazole，F(xiàn)CZ）、氟胞嘧啶（fluorocytosine，5-FC）和可溶性兩性霉素B（ampho?tericin B，AmB）均購自北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20151127、20160509、319A0529。氟胞嘧啶和可溶性兩性霉素B用雙蒸水溶解，氟康唑用二甲基甲酰胺（dimethylformamide，DMF）溶解，儲存液均配成1 280 μg∕mL，過濾除菌，分裝于1.5 mL小離心管，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基 高滲液體培養(yǎng)基按文獻〔12〕中方法稍加改進：含0.25%NaCl、0.5%葡萄糖、0.1%硫乙醇酸鈉、1%蛋白胨、0.5%酵母粉、0.5%牛肉浸膏、0.05%L-胱氨酸、20%蔗糖、10%豬血漿。高滲固體培養(yǎng)基：在上述基礎(chǔ)上加1%瓊脂。沙保氏瓊脂培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司，批號140110）。上述培養(yǎng)基分別用蒸餾水溶解后，進行高壓蒸汽滅菌，固體培養(yǎng)基制成平板，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 細胞壁染色液 按文獻〔12〕中改良方法配制：10%鞣酸水溶液，5%結(jié)晶紫水溶液，5%剛果紅水溶液。

1.2 誘導(dǎo)方法 參照美國國家臨床實驗室標準化委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standard，NCCLS）推薦的酵母菌液基稀釋法真菌藥敏試驗參考方案〔13〕，在此基礎(chǔ)上將RPMI-1640培養(yǎng)基替換為高滲液體培養(yǎng)基，并按一定方案添加抗真菌藥物，具體如下。

1.2.1 藥物稀釋 采用對倍稀釋法用高滲液體培養(yǎng)基稀釋藥物儲存液，氟康唑從160 μg∕mL至2.5 μg∕mL，兩性霉素B從80 μg∕mL至1.25 μg∕mL，氟胞嘧啶從640 μg∕mL至10 μg∕mL，均為7個稀釋度，分裝于12 mm×75 mm無菌玻璃試管，每管含0.1 mL抗真菌藥物，每種藥物均設(shè)生長（無藥）對照及空白（陰性）對照。

1.2.2 菌液接種 白假絲酵母菌菌種經(jīng)沙保氏瓊脂培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)2次以上，以激活菌種，挑取3～4個菌落用生理鹽水制成菌懸液，調(diào)整濁度為0.5麥氏單位，再用高滲液體培養(yǎng)基將此菌懸液稀釋2 000倍（接種菌液濃度約為0.5×103～2.5×103CFU∕mL），在上述含藥試管中各加入0.9 mL菌液。

1.2.3 培養(yǎng)觀察 將接種后的試管置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱，每24 h參照藥物稀釋過程繼續(xù)加入0.1 mL的對應(yīng)抗真菌藥物，培養(yǎng)24 h立即讀取每種藥物最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），并每天對試管中培養(yǎng)物進行涂片，觀察白假絲酵母菌細胞壁形態(tài)變化情況。

1.3 結(jié)果判定

1.3.1 MIC判定 因相較于RPMI-1640培養(yǎng)基，高滲液體培養(yǎng)基中營養(yǎng)更豐富，故以24 h為判定終點。與生長對照管對比，氟康唑以80%抑制生長，兩性霉素B和氟胞嘧啶以完全不生長的最低藥物濃度作為MIC。

1.3.2 L型判定 每天涂片進行細胞壁染色，在油鏡下觀察。當觀察到白假絲酵母菌染色異?；蚣毎诓煌潭热睋p時且能通過0.8 μm孔徑的無菌濾器生長判定為其L型，必要時接種高滲平板分離觀察或進行返祖試驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 氟康唑誘導(dǎo)結(jié)果 白假絲酵母菌在氟康唑誘導(dǎo)4 d后，在藥物濃度為2 μg∕mL的管中出現(xiàn)細胞壁不同程度缺損改變（圖1a）或菌體完全深染、皺縮（圖1b），此時經(jīng)0.8 μm濾器過濾未見生長，若繼續(xù)誘導(dǎo)至第6天，則過濾后有菌生長，涂片后仍可見細胞壁缺損、菌體深染及皺縮的白假絲酵母菌，其余各管在第7天時全部過濾均未見生長。此現(xiàn)象表明白假絲酵母菌細胞壁在早期出現(xiàn)異常改變時，濾過率或濾過后存活率低，當白假絲酵母菌細胞壁改變到一定程度可通過0.8 μm的濾器并生長，在第4天觀察到白假絲酵母菌細胞壁形態(tài)異常時將其轉(zhuǎn)種至高滲固體平板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，發(fā)現(xiàn)部分菌細胞壁缺損嚴重，呈“凹坑狀”（圖1c）。

2.2 兩性霉素B和氟胞嘧啶誘導(dǎo)結(jié)果 與氟康唑誘導(dǎo)結(jié)果相似，兩性霉素B誘導(dǎo)4 d后，可在藥物濃度0.5 μg∕mL的管中觀察到細胞壁輕微缺損的白假絲酵母菌（圖1d），繼續(xù)誘導(dǎo)至第6天時能通過0.8 μm的濾器生長，涂片細胞壁染色見大部分白假絲酵母菌細胞壁完整，說明在抗真菌藥物抑菌作用減縮或消失后，白假絲酵母菌L型能快速恢復(fù)至正常；白假絲酵母菌在氟胞嘧啶誘導(dǎo)1 d后，肉眼可見各管中菌量隨藥物濃度升高而減少，誘導(dǎo)至第2天肉眼可見各管中菌量與生長對照管無明顯差別，說明白假絲酵母菌對氟胞嘧啶耐受較強，氟胞嘧啶對白假絲酵母菌的抑菌作用較差，連續(xù)誘導(dǎo)7 d未觀察到白假絲酵母菌細胞壁形態(tài)異常改變，過濾各管中培養(yǎng)物均無生長。

圖1 氟康唑和兩性霉素B誘導(dǎo)的白假絲酵母菌L型（細胞壁染色，10×100）

2.3 不同藥物的MIC及誘導(dǎo)出L型菌的劑量和時間分析 不同抗真菌藥物分別誘導(dǎo)白假絲酵母菌24 h后，測定各藥物對白假絲酵母菌的MIC。氟康唑的MIC為8 μg∕mL，兩性霉素B的MIC為4 μg∕mL，氟胞嘧啶的MIC為64 μg∕mL。將MIC和誘導(dǎo)情況綜合分析發(fā)現(xiàn)，氟康唑和兩性霉素B連續(xù)誘導(dǎo)4 d，在MIC之后2～3個對倍濃度的管中均發(fā)現(xiàn)細胞壁不同程度缺損或染色異常的白假絲酵母菌，繼續(xù)誘導(dǎo)2 d后，可通過0.8 μm的濾器生長；氟胞嘧啶在實驗濃度下誘導(dǎo)7 d未觀察到細胞壁形態(tài)異常改變的白假絲酵母菌，過濾后無生長，見表1。除氟胞嘧啶外，氟康唑和兩性霉素B均能誘導(dǎo)出白假絲酵母菌L型，且誘導(dǎo)出白假絲酵母菌L型的藥物濃度在MIC之后某個濃度附近，說明在臨床治療白假絲酵母菌病時也可能存在其L型，從而對臨床檢驗和治療產(chǎn)生干擾。

表1 不同抗真菌藥物誘導(dǎo)情況

3 討論

白假絲酵母菌屬于條件致病菌，在機體免疫力降低時，可引起皮膚黏膜及內(nèi)臟器官的感染，尤其對AIDS、結(jié)核病等免疫力低下患者威脅更大，是臨床上感染率和致死率極高的一種真菌〔14〕。由于抗真菌藥物的長期反復(fù)治療，易產(chǎn)生快速耐藥性，給臨床治療白假絲酵母菌病增加了難度。因此，研究抗真菌藥物的潛在作用靶點及白假絲酵母菌的耐藥機制成為當前研究熱點〔15〕。目前常用的抗真菌藥物中，氟康唑能影響真菌細胞膜麥角固醇合成的關(guān)鍵酶，阻止麥角固醇的生物合成，兩性霉素B能直接與細胞膜上的麥角固醇結(jié)合，二者均以導(dǎo)致真菌細胞膜通透性增加，細胞膜完整性被破壞而產(chǎn)生抗真菌作用；氟胞嘧啶則是通過進入細胞內(nèi)，干擾嘧啶堿基的代謝，抑制真菌核酸的合成而產(chǎn)生抗真菌作用〔16〕。但有學者認為，兩性霉素B對真菌細胞壁合成具有限速作用，能導(dǎo)致真菌細胞壁產(chǎn)生適應(yīng)性改變而產(chǎn)生耐藥性〔17〕。氟康唑能導(dǎo)致念珠菌因細胞壁損傷而膨脹變形，蔡善民等在電鏡下觀察到氟康唑注射液能導(dǎo)致幾種不同念珠菌細胞壁缺損、扭曲及塌陷變形〔18〕。本研究采用氟康唑、兩性霉素B和氟胞嘧啶3種不同作用機制的抗真菌藥物，在NCCLS推薦的酵母菌液基稀釋法藥敏試驗的基礎(chǔ)上，通過模擬臨床給藥周期連續(xù)給藥，在油鏡下觀察對白假絲酵母菌細胞壁結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響，結(jié)果顯示，氟康唑和兩性霉素B均能影響白假絲酵母菌細胞壁的完整性，油鏡下觀察到細胞壁缺損、菌體深染或皺縮，并能通過0.8 μm的濾器繼續(xù)生長繁殖；氟胞嘧啶在同樣條件下未能誘導(dǎo)出。由于氟康唑和兩性霉素B均作用于真菌細胞膜，氟胞嘧啶作用于真菌核質(zhì)，因此白假絲酵母菌L型產(chǎn)生可能是抗真菌藥物導(dǎo)致真菌細胞膜損傷后間接影響其細胞壁的生物合成，從而導(dǎo)致真菌細胞壁完整性被破壞。

文獻表明〔19〕，真菌受抗真菌藥物、人體內(nèi)溶菌酶或其他因素的作用，能形成與細菌L型相似的缺壁型，真菌的缺壁型仍具有生命力和一定的致病性，在影響因素消除后，能快速恢復(fù)，當其細胞壁缺損嚴重時，菌體易發(fā)生變形，可通過0.8 μm的濾器。但對抗真菌藥物誘導(dǎo)真菌形成L型的劑量和時間條件并未深入研究，有關(guān)真菌L型存在形態(tài)的圖像資料也有局限性。因此，本研究利用改良細胞壁染色法，在油鏡下觀察不同藥物濃度和時間條件下抗真菌藥物誘導(dǎo)白假絲酵母菌形成L型的形態(tài)改變情況，發(fā)現(xiàn)氟康唑和兩性霉素B分別作用4 d后，能在最低抑菌濃度之后2個對倍濃度觀察到細胞壁呈明顯缺損的白假絲酵母菌L型，主要表現(xiàn)為“凹坑狀”、菌體深染或皺縮。據(jù)馬晟利等〔20〕報道，血鏈球菌細菌素作用念珠菌24 h可導(dǎo)致念珠菌細胞膜通透性和菌體細胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，電鏡下可見菌體細胞皺縮，質(zhì)壁分離，菌體細胞膜及細胞壁凹坑狀缺損，細胞壁及細胞膜連續(xù)性破壞或斷裂等不同形態(tài)改變。本實驗在油鏡下的觀察結(jié)果與之相似，盡管血鏈素抑菌機制還未完全闡明，但現(xiàn)階段研究表明，血鏈素和氟康唑、兩性霉素B等抗真菌藥均能促使白假絲酵母菌細胞膜通透性改變，導(dǎo)致細胞壁形態(tài)變化，形成L型菌。

本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然在特定藥物濃度和時間條件下，白假絲酵母菌細胞壁可發(fā)生不同程度的缺失，但仍然能通過自身修復(fù)繁殖。將白假絲酵母菌L型轉(zhuǎn)種到高滲固體平板或沙保氏瓊脂培養(yǎng)基，大部分白假絲酵母菌均能恢復(fù)完整細胞壁，經(jīng)0.8 μm的濾器過濾后觀察生長的白假絲酵母菌L型，僅能在較少視野中發(fā)現(xiàn)，大部分念珠菌細胞壁結(jié)構(gòu)完整。白假絲酵母菌的L型可能是抗真菌藥持續(xù)作用時，少數(shù)白假絲酵母菌與抗真菌藥物之間形成的一種暫時平衡狀態(tài)，當藥物作用減弱或消失后便能迅速恢復(fù)完整的細胞壁，可能在此平衡狀態(tài)白假絲酵母菌能較好耐受抗真菌藥物而不被殺死，對其具體作用機制還需要進一步實驗研究。

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