羅格列酮對大鼠酒精性肝炎的保護作用

揭英錫 ，鄧艷紅 ，陳小淑 ，陳泳珊 ，徐澤曦 ，王朝聰 ，朱曉琴

1.廣州醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院麻醉學(xué)系，廣東廣州 511436；2.廣州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院機能實驗中心，廣東廣州 511436

近年來酒桌文化盛行，酒精性肝炎（Alcoholic Hepatitis,AH）發(fā)病率逐漸上升[1]，已成為繼病毒性肝炎后的第二大肝臟疾病，嚴(yán)重危害人們的健康[2]。目前對于AH，常規(guī)的治療方法包括戒酒、營養(yǎng)支持和藥物干預(yù)[3]。文獻表明[4]，羅格列酮(Rosiglitazone,RSG)在諸多器官的急慢性炎性病變中發(fā)揮著一定的抗炎作用，但是羅格列酮對于酒精性肝炎的保護作用，尚沒有相關(guān)文獻報道。因此，開展酒精性肝炎中羅格列酮對肝臟的保護作用的科學(xué)研究，具有一定的現(xiàn)實意義。20只SD雌性大鼠造模6周（2017年7—8月），該文在此基礎(chǔ)上，報道關(guān)于羅格列酮對酒精性肝炎保護作用的實驗研究結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物

鹽酸羅格列酮膠囊(國藥準(zhǔn)字H20052455)，醋酸潑尼松片 (國藥準(zhǔn)字H44020682),北京二鍋頭酒，大鼠MDA ELISA試劑盒，包埋液。

1.2 動物分組與模型制備

成年SD雌性大鼠 20只，體重200～250 g，隨機分為正常組、酒精肝模型組、陽性對照組、羅格列酮處理組（n=5）。具體分組情況如下：正常組自由進食飲水，其余組均采用灌胃法聯(lián)合酒精飲料自由飲用法構(gòu)建大鼠慢性酒精性肝炎模型[5]。灌胃白酒6 mL/(kg·d)，其酒精體積分?jǐn)?shù)依次為30%、35%、40%、45%，每周遞增，在體積分?jǐn)?shù)為45%時持續(xù)3周；自由飲用法酒精體積分?jǐn)?shù)依次為15%、20%、25%、30%，每周遞增，在體積分?jǐn)?shù)為30%時持續(xù)3周。每日灌胃白酒6 h后，酒精肝模型組、陽性對照組、羅格列酮處理組分別灌胃生理鹽水 1.0 mg/(kg·d)、潑尼松[6]0.5 mg/(kg·d)、羅格列酮 1.0 mg/(kg·d)。6周后取大鼠血清及肝臟進行相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.3 模型制備成功的判定指標(biāo)

與正常組比較，酒精肝模型組大鼠血清中ALT、AST、MDA含量顯著升高，肝臟指數(shù)明顯增大，肝臟切片觀察可見肝細(xì)胞脂肪樣變及炎癥細(xì)胞浸潤；陽性對照組與羅格列酮處理組大鼠各項檢測指標(biāo)較酒精肝模型組有顯著差異[7]。

1.4 樣本提取與指標(biāo)檢測

1.4.1 血清檢測 6周后，大鼠稱重（禁食12 h），10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射。大鼠麻醉后，取下腔靜脈血 4～6 mL，室溫靜置 1.5 h，離心提取血清，-80℃冰箱保存，送醫(yī)院檢測ALT、AST含量。按照試劑盒方法檢測血清MDA含量。

1.4.2 肝臟指數(shù)測量取新鮮肝臟置于PBS-20%蔗糖溶液泡洗數(shù)次，濾紙吸干表面溶液，肝臟稱重記錄數(shù)據(jù)，計算肝臟指數(shù)。

1.5 肝組織形態(tài)學(xué)觀察

取新鮮肝臟，肝葉縱切5 mm，包埋液包埋，置于-20℃緩凍，次日取出置于-80℃保存，制備冰凍切片，HE染色，光鏡觀察。

1.6 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 血清ALT、AST含量變化

測定各組大鼠血清ALT、AST含量，與正常組比較，其余 3 組 ALT、AST 含量明顯升高（P＜0.05）；與酒精肝模型組比較，羅格列酮處理組及陽性對照組ALT、AST 含量明顯下降（P＜0.05）；羅格列酮處理組與陽性對照組ALT、AST含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表 1。

表 1 各組大鼠血清 ALT、AST 含量比較[（±s），U/L]

表 1 各組大鼠血清 ALT、AST 含量比較[（±s），U/L]

注：與正常組比較，aP＜0.05；與酒精肝模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＞0.05。

組別ALT AST羅格列酮處理組（n=5）陽性對照組（n=5）酒精肝模型組（n=5）正常組（n=5）（59.0±10.0）abc（47.0±8.0）ab（85.5±10.5）24.5±3.5（97.5±10.5）abc（91.5±18.5）ab（179.0±37.0）a 60.0±12.0

2.2 血清MDA含量變化

測定各組大鼠血清MDA含量，與正常組比較，其余3組MDA含量明顯升高（P＜0.05）；與酒精肝模型組比較，羅格列酮處理組及陽性對照組MDA含量明顯下降 （P＜0.05）；羅格列酮處理組與陽性對照組MDA含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清MDA含量比[（±s）,nmol/L]

表2 各組大鼠血清MDA含量比[（±s）,nmol/L]

注：與正常組比較，aP＜0.05；與酒精肝模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＞0.05。

組別MDA羅格列酮處理組（n=5）陽性對照組（n=5）酒精肝模型組（n=5）正常組（n=5）（122.6±24.4）abc（122.7±22.6）ab（225.7±21.5）a 82.5±7.5

2.3 肝組織形態(tài)學(xué)觀察

2.3.1 肉眼觀 正常組大鼠肝臟被膜光滑，呈紅褐色，明亮有光澤。酒精肝模型組大鼠肝臟體積明顯增大，包膜緊張，邊緣圓鈍，顏色淺黃，與周圍組織有黏連，切面油膩，無光澤。羅格列酮處理組和陽性對照組肝臟變化介于正常組與酒精肝模型組之間，切面無明顯油膩感，尚有光澤。各組大鼠肝臟指數(shù)比較見表3。

表3 各組大鼠肝臟指數(shù)比較[（±s）,%]

表3 各組大鼠肝臟指數(shù)比較[（±s）,%]

注：與正常組比較，aP＜0.05；與酒精肝模型組比較，bP＜0.05；與陽性對照組比較，cP＞0.05。

組別肝臟指數(shù)羅格列酮處理組（n=5）陽性對照組（n=5）酒精肝模型組（n=5）正常組（n=5）（2.44±0.12）abc（2.41±0.05）ab（2.99±0.12）a 2.09±0.16

2.3.2 HE染色 正常組大鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細(xì)胞形態(tài)正常，小葉結(jié)構(gòu)正常（圖1A）。酒精肝模型組肝細(xì)胞腫脹、點狀壞死及炎癥細(xì)胞浸潤（圖1B）。羅格列酮處理組（圖1C）和陽性對照組（圖1D）肝細(xì)胞輕度腫脹及脂肪樣變，但無明顯肝細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤。各組大鼠形態(tài)觀察見圖1（HE 染色）。

3 討論

長期大量飲酒是導(dǎo)致酒精性肝炎的主要原因，目前多數(shù)認(rèn)為其發(fā)病機制與氧化應(yīng)激有關(guān)。乙醇進入機體后，經(jīng)肝臟代謝產(chǎn)生大量乙醛、自由基等氧化物，消耗大量抗氧化因子[8]。當(dāng)抗氧化因子不能及時清除氧化物時，肝細(xì)胞膜就會發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[9]，引起肝細(xì)胞炎癥，導(dǎo)致肝細(xì)胞腫脹、脂肪變性、壞死及炎癥細(xì)胞浸潤，甚至纖維化[10]。

圖1 HE染色下4組大鼠形態(tài)觀察

該實驗檢測ALT、AST、MDA血清學(xué)指標(biāo)，其依據(jù)為：①MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要終產(chǎn)物，其含量多少能直接反映機體脂質(zhì)過氧化損傷的程度[11]。②當(dāng)肝細(xì)胞發(fā)生變性、壞死等損害時，細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致血清中ALT、AST含量升高。所以，ALT、AST是目前臨床上最常用的肝損傷診斷指標(biāo)[12]。按聯(lián)合法造模6周，取血清檢測ALT、AST、MDA含量，肝臟切片觀察。形態(tài)學(xué)結(jié)果提示該實驗造模成功，給予酒精的組別均出現(xiàn)不同程度肝實質(zhì)損傷，與酒精肝模型組比較，羅格列酮處理組肝組織損傷減輕。生化結(jié)果顯示，羅格列酮處理組血清ALT、AST、MDA的含量低于酒精肝模型組。綜上可得，羅格列酮處理組脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度及肝功能損傷程度低于酒精肝模型組。

羅格列酮屬于PPAR-γ激動劑,而PPAR-γ通路可以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、氧化應(yīng)激和炎癥因子的產(chǎn)生影響器官發(fā)病過程。急性胰腺炎所致肝損傷、心肌炎等同為器官炎癥，羅格列酮處理后可減輕損傷。陸貝等[13]通過對急性胰腺炎大鼠肝損傷的研究發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可能通過抑制NF-κB信號傳導(dǎo)通路的活性，下調(diào)下游促炎細(xì)胞因子水平，從而減輕急性胰腺炎過程中的肝細(xì)胞損傷。李戈等[14]通過研究小鼠自身免疫性心肌炎發(fā)現(xiàn)，羅格列酮可以明顯減輕小鼠實驗性自身免疫性心肌炎病情，抑制心肌炎癥反應(yīng)，羅格列酮的這種作用可能是通過減少IL-17的表達實現(xiàn)的。酒精性肝炎造模過程中給予羅格列酮，該組氧化指標(biāo)MDA（122.6±24.4）nmol/L含量低于酒精肝模型組 MDA（225.7±21.5）nmol/L含量，說明該組脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度減輕。結(jié)合生化及形態(tài)學(xué)結(jié)果，對比陸貝、李戈等研究，我們推測羅格列酮可能通過激活PPAR-γ通路后抑制肝細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)及減少炎癥因子的產(chǎn)生，從而起到了肝細(xì)胞保護的作用。

綜上所述，該實驗說明PPAR-γ通路與抗氧化應(yīng)激存在聯(lián)系，這為酒精性肝炎的藥物研究提供一個新思路，希望有更多的PPAR-γ激動劑被應(yīng)用到酒精性肝炎的藥物研究中。該課題第二階段的研究會側(cè)重于羅格列酮抗氧化應(yīng)激的具體機制，結(jié)合該次實驗指標(biāo)，增加 SOD、GSH、GSH-Px、T-AOC 等指標(biāo)的檢測；同時，羅格列酮對酒精性肝炎的保護作用與NF-κB信號傳導(dǎo)通路是否有關(guān)，有待深入研究，實驗過程中可以檢測IL-1、IL-6、IL-17等炎癥指標(biāo)水平以及利用免疫組化法觀察NF-κB在酒精性肝炎發(fā)生發(fā)展過程中的變化。

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