UFLC法同時(shí)測(cè)定甘草及其炮制品中2種活性成分的含量

關(guān) 皎，王 強(qiáng)，孫宇慧，費(fèi) 雪，王黎明，郝乘儀，馮 波，朱鶴云

(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院,吉林 吉林 132013)

甘草在中藥傳統(tǒng)方劑中頻繁使用，有“十方九草”之說。甘草具有補(bǔ)脾益氣、淸熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的功效[1]。甘草中主要含有三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類和多糖類成分，其中三萜皂苷類(代表藥物為甘草酸)和黃酮類(代表藥物為甘草苷)為甘草中的主要活性成分。研究表明，甘草酸具有抗病毒、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、保肝、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)吸收等多種藥理活性[2-3]，甘草苷具有抗抑郁、保肝、神經(jīng)保護(hù)等藥理活性，同時(shí)對(duì)心肌缺血具有較好的治療作用[4-6]。目前關(guān)于甘草的質(zhì)量研究已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，采用的方法包括紫外法[7]、熒光法[8]、高效液相色譜法[9-10]等。然而，這些方法存在樣品前處理方法復(fù)雜、方法專屬性和靈敏度差、分析時(shí)間過長(zhǎng)等缺點(diǎn)。超快速液相色譜(ultra-fast liquid chromatography,UFLC)技術(shù)由于存在分析效率高、平衡時(shí)間短、溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，近年來廣泛應(yīng)用于中藥及中藥復(fù)方的化學(xué)分析研究[11-12]。本研究首次采用UFLC法同時(shí)測(cè)定甘草及其炮制品中甘草苷和甘草酸的含量，旨在為甘草的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和質(zhì)量控制研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

日本島津LC-20AD UFLC色譜儀系統(tǒng)，包括自動(dòng)進(jìn)樣裝置、二元高壓輸液泵、柱溫箱，紫外檢測(cè)器，LC solution色譜工作站；KQ-250DE型數(shù)控聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CPA 225D型十萬分之一電子天平(德國賽多利斯儀器有限公司)。

甘草藥材(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古)購自吉林大藥房，由吉林醫(yī)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室李景華副教授進(jìn)行鑒定，確定為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。炙甘草(產(chǎn)地：內(nèi)蒙古)購自吉林大藥房。

色譜純乙腈和甲醇均購自美國Fisher公司，所用水為二次蒸餾水，其他試劑均為分析純。對(duì)照品甘草苷(批號(hào)111610-201607)購自中國食品藥品檢定研究院，甘草酸(批號(hào)151014)購自成都普菲德生物技術(shù)有限公司，各對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的配制

分別精密稱取甘草苷和甘草酸對(duì)照品適量，置于5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別配制含甘草苷1.0 g/mL和甘草酸1.0 g/mL的對(duì)照品溶液備用。

2.2 供試品溶液的制備

稱取預(yù)先通過40目篩的甘草藥材粉末約0.2 g，置25 mL具塞碘量瓶中，加入50%乙醇25 mL，稱定重量，超聲提取30 min后，放冷，再次稱定重量，并用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Shimadzu Shim-Pack XR-ODS柱(75 mm×3.0 mm,2.2 m)；流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～4 min，5%～20%乙腈；4～8 min，20%～40%乙腈；8～12 min，40%～45%乙腈，平衡時(shí)間2 min；體積流量0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量5 μL。色譜圖見圖1。

圖 1 混合對(duì)照品(A)和甘草樣品(B)的色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.1”項(xiàng)下的制備甘草苷和甘草酸對(duì)照品溶液適量，置于相同5 mL容量瓶中，用甲醇-水(50∶50,v/v)配制成甘草苷和甘草酸濃度均為10、20、50、100、200、500 mg/L的混合對(duì)照品溶液，依次注入U(xiǎn)FLC，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，獲得甘草苷和甘草酸的線性回歸方程分別為：

Y=13 566X+59 140，R=0.999 8

Y=3 615.7X+10 400，R=0.999 9

結(jié)果表明，甘草苷與甘草酸濃度在10～500 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液(甘草苷與甘草酸濃度分別為100 mg/L)5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果甘草苷和甘草酸峰面積的RSD(n=6)分別為0.4%和0.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一批次的甘草樣品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果甘草苷和甘草酸峰面積的RSD分別為0.7%和1.9%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批甘草藥材樣品共6份，精密稱定，分別制備樣品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算甘草苷和甘草酸的含量分別為1.85%和4.85%，RSD分別為1.6%和2.3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知含量(甘草苷和甘草酸含量分別為1.85%和4.85%)的甘草樣品粉末9份，每份0.1 g，精密稱定，分別加入相當(dāng)于樣品中甘草苷和甘草酸含量的80%、100%、120%的對(duì)照品溶液適量，各3份。制備樣品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算甘草苷和甘草酸的加樣回收率和RSD，結(jié)果甘草苷的加樣回收率為98.9%、99.5%、98.4%，RSD為1.5%、2.1%、0.9%；甘草酸的加樣回收率99.2%、99.4%、99.4%，RSD為2.2%、1.3%、1.2%。

2.9 樣品含量測(cè)定

精密稱取6批甘草樣品粉末(其中1～3批為生甘草，4～6批為炙甘草)，制備樣品溶液，進(jìn)樣分析，每個(gè)溶液進(jìn)樣3次，計(jì)算甘草苷和甘草酸的含量。樣品測(cè)定結(jié)果見表1。

表 1 樣品中甘草苷、甘草酸的含量測(cè)定結(jié)果(n=6，%)

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)比較考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-1.0%甲酸水、乙腈-1.0%乙酸水、乙腈-0.05%磷酸水共5種流動(dòng)相體系，結(jié)果表明，在確定的波長(zhǎng)下，乙腈-0.05%磷酸水所得基線更平穩(wěn)，各色譜峰的分離度更好，且色譜分析時(shí)間僅為15 min。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

采用PDA檢測(cè)器對(duì)樣品在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，甘草苷和甘草酸分別在276 nm和248 nm處有最大吸收。綜合比較發(fā)現(xiàn)237 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)的色譜圖基線平穩(wěn)，各主要特征峰吸收強(qiáng)度較大，故選定該波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法及提取溶劑的選擇

實(shí)驗(yàn)中考察了回流法和超聲法提取甘草中甘草苷和甘草酸的提取效果，采用超聲提取法時(shí)兩種活性成分的含量明顯高于回流提取法。本實(shí)驗(yàn)對(duì)比不同比例乙醇溶液和不同比例甲醇溶液對(duì)甘草中2種活性成分的提取效率，結(jié)果表明50%乙醇的綜合提取效率最高，故本實(shí)驗(yàn)采用50%乙醇作為提取溶劑。

本研究采用UFLC法同時(shí)測(cè)定了3批生甘草和3批炙甘草中上述2種活性成分的含量。購自吉林大藥房的3批生甘草和3批炙甘草的含量均符合藥典要求(藥典規(guī)定甘草中甘草苷含量不低于0.50%，甘草酸含量不低于2.0%；炙甘草中甘草苷含量不低于0.50%，甘草酸含量不低于1.0%)。但炮制后甘草中2種活性成分含量下降，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致[11]，甘草炮制后含蜂蜜固形物量增加有關(guān)約為11.8%，若扣除含蜂蜜固形物的量，炮制后甘草苷和甘草酸的平均含量均高于生品，由此可見甘草經(jīng)蜜炙后入藥具有一定的科學(xué)性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:2015年版一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2015:86-88.

[2] 史曉月.甘草酸藥理機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中外醫(yī)療，2010,29(16):125.

[3] 張明發(fā)，沈雅琴.甘草酸抗病毒藥理研究進(jìn)展[J].中國執(zhí)業(yè)藥師，2008,5(12):18-22.

[4] 肖淵.甘草苷的抗抑郁作用及其機(jī)理研究[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2009.

[5] 丁選勝，戴德哉.甘草苷對(duì)CCl4肝臟毒性的保護(hù)作用[J].中藥藥理與臨床，2002,18(6):12-13.

[6] 蘇國林，劉剛，劉育辰，等.甘草苷的提取純化方法和藥理作用研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2013,13(10):48-51.

[7] 馮薇，王文全，趙平然.甘草總黃酮含量測(cè)定方法研究[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2007,18(11):2608-2610.

[8] 孫艷濤，趙月，任曉宇，等.熒光光譜法測(cè)定甘草中甘草苷的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2013,32(9):1210-1213.

[9] 劉雅茜，王夢(mèng)月，史海明，等.高效液相色譜法測(cè)定甘草及其炮制品中5種活性成分的含量[J].中國藥學(xué)雜志，2008,43(16):1268-1271.

[10] 章厲劼，孫真崢.HPLC法測(cè)定四君子散中甘草酸的含量[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2017,59(7):286-288.

[11] 李國俊.高效液相色譜法快速檢測(cè)中藥復(fù)方炮制液中芍藥苷含量[J].河北省科學(xué)院學(xué)報(bào)，2013,30(3):59-62.

[12] 李啟艷，王榮梅.快速溶劑萃取-超高效液相色譜法測(cè)定穩(wěn)心顆粒中皂苷類成分[J].藥物分析雜志，2015,35(3):528-531.