胎齡≤34周的漢族早產(chǎn)兒臍帶血內(nèi)皮型一氧化氮合成酶基因多態(tài)性及其與早產(chǎn)兒主要并發(fā)癥的關(guān)系研究

常紹鴻，欒斌，張衛(wèi)星

一氧化氮（NO）是人體重要的神經(jīng)遞質(zhì)和舒血管因子，對維持血壓穩(wěn)定具有重要作用。內(nèi)源性NO主要受一氧化氮合成酶的調(diào)節(jié)，其中內(nèi)皮型一氧化氮合成酶（eNOS）是一氧化氮合成酶的一個(gè)亞型，大量研究證實(shí)eNOS基因多態(tài)性可改變NO產(chǎn)生水平，并與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)［1-2］。國外有研究證實(shí)eNOS基因多態(tài)性與早產(chǎn)兒的主要并發(fā)癥有關(guān)，但結(jié)論并不一致［3-4］。目前，國內(nèi)罕有這方面的研究，本研究以新鄉(xiāng)市漢族早產(chǎn)兒為研究對象，探討eNOS基因多態(tài)性與早產(chǎn)兒主要并發(fā)癥的關(guān)系，為精準(zhǔn)醫(yī)療提供臨床證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2014年2月—2016年12月于新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院出生的早產(chǎn)兒，符合以下條件者入選本研究：（1）父母均為漢族，祖籍均為河南北部；（2）出生時(shí)胎齡≤34周。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）已知的先天性畸形，如先天性心臟病、先天性神經(jīng)管發(fā)育異常等；（2）已知的染色體異常，如21-三體綜合征、18-三體綜合征等，以及明顯的面容異常伴有掌指紋異常者；（3）多胎。早產(chǎn)兒法定監(jiān)護(hù)人了解本研究過程，并簽署書面同意書。最終入選早產(chǎn)兒231例。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 產(chǎn)科記錄 包括孕周、母親分娩方式及新生兒的性別、出生體質(zhì)量、5 min阿氏評分；產(chǎn)前行激素治療情況。

1.2.2 兒科記錄 包括患兒住院情況及主要并發(fā)癥、結(jié)局。

住院情況：肺表面活性物質(zhì)（PS）應(yīng)用、行有創(chuàng)機(jī)械通氣治療、發(fā)生低血壓或休克、發(fā)生敗血癥、發(fā)生動脈導(dǎo)管未閉、吸氧治療、發(fā)生呼吸暫停的情況。

主要并發(fā)癥：包括支氣管肺發(fā)育不良（BPD）、壞死性小腸結(jié)腸炎（NEC）、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病（ROP）Ⅲ～Ⅴ期、腦室周圍-腦室內(nèi)出血（PIVH）Ⅲ～Ⅳ級、需要行有創(chuàng)機(jī)械通氣治療的新生兒呼吸窘迫綜合征（RDS）。

BPD、NEC的診斷及分級依據(jù)《實(shí)用新生兒學(xué)》［5］。ROP的篩查時(shí)機(jī)、診斷標(biāo)準(zhǔn)和分期依據(jù)文獻(xiàn)［6］。PIVH確診主要依據(jù)顱腦超聲和顱腦MRI檢查結(jié)果，少數(shù)依據(jù)顱腦CT檢查結(jié)果［5］。RDS的診斷依據(jù)參考文獻(xiàn)［7］，當(dāng)滿足以下條件之一時(shí)給予氣管插管、機(jī)械通氣治療：（1）頻繁呼吸暫停；（2）吸入氧濃度=0.6，且氧分壓＜50 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）或者經(jīng)皮血氧飽和度＜85%（紫紺型先天性心臟病除外）；（3）二氧化碳分壓＞60～65 mm Hg，伴有酸中毒（pH＜7.20）。

考慮患者的臨床治療方法和預(yù)后不同，本研究僅對ROPⅢ～Ⅴ期、PIVH Ⅲ～Ⅳ級、需要行有創(chuàng)機(jī)械通氣治療的RDS的早產(chǎn)兒的診治資料進(jìn)行分析。

結(jié)局分為死亡和未死亡。死亡病例是指住院時(shí)間超過72 h因病情嚴(yán)重而放棄治療，且放棄治療后8 h內(nèi)死亡的早產(chǎn)兒；不包括家屬要求姑息治療且生后24 h內(nèi)死亡的早產(chǎn)兒。

1.3 基因多態(tài)性測定 患兒均于臍帶結(jié)扎后立即取臍動脈血5 ml，采用北京天根公司基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，eNOS基因多態(tài)性位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［8］，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。rs2070744引物為：上游5'-GTGTACCCCACCTGCATTCT-3'，下 游 5'-CCCAGCAAGGATGTAGTGAC-3'；rs1799983 引物 為： 上 游 5'-CACTCCCCACAGCTCTGCAT-3'， 下游 5'-CAATCCCTTTGGTGCTCACG-3'；rs61722009引 物為： 上 游5'-CTATGGTAGTGCCTTGGCTGGAGG-3'， 下 游5'-ACCGCCCAGGGAACTCCGCT-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（）表示，計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)表示；采用單因素分析和多因素Logistic回歸分析分析各基因多態(tài)性與主要并發(fā)癥的關(guān)系。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料及主要結(jié)局 231例早產(chǎn)兒中男109例、女122例，出生體質(zhì)量為（1 770.8±632.1）g。其中PIVH Ⅲ～Ⅳ級早產(chǎn)兒54例（23.4%），需要行有創(chuàng)機(jī)械通氣治療的RDS早產(chǎn)兒63例（27.3%），ROP Ⅲ～Ⅴ期早產(chǎn)兒32例（13.9%）。一般資料及主要結(jié)局見表1。

表1 231例早產(chǎn)兒部分一般資料及結(jié)局Table 1 Baseline data and main outcome of 231 Han premature infants of≤34 weeks' gestational age

2.2 最小等位基因頻率（MAF） 231例早產(chǎn)兒單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點(diǎn)及基因型分布見表2。rs2070744 C MAF為0.145、rs1799983 T MAF為0.188、rs6172009 a MAF為0.159。本研究與Ensembl數(shù)據(jù)庫中的中國北京漢族（CHB）和中國南方漢族（CHS）［9-10］rs2070744和rs1799983 MAF比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，見表3），提示本研究對象有代表意義。因Ensembl數(shù)據(jù)庫中缺乏中國漢族rs61722009基因型和等位基因數(shù)據(jù)，未進(jìn)行相關(guān)比較。

2.3 單因素分析 單因素分析結(jié)果示rs2070744的TC+CC基因型和rs1799983的GT+TT基因型分別增加了BPD的發(fā)生率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；rs1799983 GT+TT基因型增加了ROP Ⅲ～Ⅴ期發(fā)生率（P＜0.05，見表4）。

2.4 多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析結(jié)果示rs2070744 TC+CC基因型為早產(chǎn)兒發(fā)生BPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05，見表5）；rs61722009 aa+ab基因型和rs1799983 GT+TT基因型同時(shí)存在是早產(chǎn)兒發(fā)生ROP Ⅲ～Ⅴ級發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05，見表6）。

表2 231例早產(chǎn)兒SNP位點(diǎn)及基因型分布〔n（%）〕Table 2 Distribution of SNP and genotypes in 231 Han premature infants of ≤34 weeks' gestational age

表3 本研究等位基因頻率與Ensembl數(shù)據(jù)庫已知數(shù)據(jù)比較〔n（%）〕Table 3 Allele frequency in this study versus known data in Ensembl genome database

表5 早產(chǎn)兒發(fā)生BPD影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 5 Multiple Logistic regression analysis of the associated factors of BPD in 231 Han premature infants of ≤34 weeks' gestational age

表6 早產(chǎn)兒發(fā)生ROP Ⅲ～Ⅴ期影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 6 Multiple Logistic regression analysis of the associated factors of stage Ⅲ - Ⅴ ROP in 231 Han premature infants of ≤ 34 weeks' gestational age

表4 基因型與早產(chǎn)兒主要并發(fā)癥的關(guān)系〔n（%）〕Table 4 Relationship between genotypes and the major complications of 231 Han premature infants of ≤34 weeks' gestational age

3 討論

隨著新生兒救護(hù)技術(shù)的提高，早產(chǎn)兒存活率明顯提高，同時(shí)早產(chǎn)兒相關(guān)的嚴(yán)重后果也越來越受到關(guān)注，并成為一個(gè)重要的社會問題。受早產(chǎn)兒自身發(fā)育的特點(diǎn)和醫(yī)療操作的影響，早產(chǎn)兒更容易發(fā)生全身和/或局部組織器官的血流動力學(xué)改變，有證據(jù)顯示這種血流動力學(xué)改變和多種早產(chǎn)兒嚴(yán)重并發(fā)癥相關(guān)［11-12］。

一氧化氮合成酶有3種同工酶，即內(nèi)皮型、神經(jīng)型和誘導(dǎo)型，其是不同基因編碼的結(jié)果，且作用于不同器官產(chǎn)生不同的病理生理作用［13］。eNOS在血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生內(nèi)皮型一氧化氮（eNO），eNO是重要的舒血管因子，在維持血管張力的恒定和調(diào)節(jié)血壓穩(wěn)定性中發(fā)揮重要作用。當(dāng)血管受到血流沖擊，灌注壓突然升高時(shí)，可舒張動脈血管，降低全身動脈血壓，控制全身血管床的靜息張力，同時(shí)也可增加局部血流、抑制血小板和白細(xì)胞聚集、維持器官血流量的相對穩(wěn)定。eNOS基因多態(tài)性普遍存在，共有10余種，研究證實(shí)，其中1種單核苷酸多態(tài)性與臨床各種疾病密切相關(guān)，分別是：（1）位于第4內(nèi)含子區(qū)，有重復(fù)4次、5次兩種形式，稱為4b/a，在NCBI的序列號為rs61722009；（2）位于啟動子區(qū)的第786號位點(diǎn)的T置換為C，稱為T786C，在NCBI的序列號為rs2070744；（3）位于第7外顯子區(qū)的第894號位點(diǎn)的G置換為T，稱為G894T，在NCBI的序列號為rs1799983［14］。大量研究表明，eNOS基因多態(tài)性影響了人體內(nèi)NO水平，從而影響多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程［1-3］。

關(guān)于eNOS基因多態(tài)性與早產(chǎn)兒結(jié)局的關(guān)系，國外有研究發(fā)現(xiàn)早產(chǎn)兒腦癱的發(fā)生和eNOS基因多態(tài)性有關(guān)［15］，隨后多國學(xué)者對不同人群進(jìn)行了范圍更廣的研究，RUSAI等［16］以105例出生體質(zhì)量≤2 000 g且為ROP Ⅲ～Ⅴ期的早產(chǎn)兒為觀察組，127例同體質(zhì)量患ROPⅠ～Ⅱ期的早產(chǎn)兒為對照組，研究發(fā)現(xiàn)eNOS基因4b/a多態(tài)性中，aa基因型為ROP Ⅲ～Ⅴ期的高危因素，與T786C無關(guān)。而YANAMANDRA等［17］研究卻發(fā)現(xiàn)T786C多態(tài)性明顯增加了ROP的發(fā)生率，其研究對象為146例美國早產(chǎn)兒，包括白種人和非裔美國人，該研究還報(bào)道等位基因C的基因頻率在白種人和非裔美國人之間有明顯區(qū)別，提示不同人種之間基因的差別可能是非裔美國人發(fā)生ROP的概率明顯小于白種人的原因。其他早產(chǎn)兒并發(fā)癥的研究也出現(xiàn)了不一致的現(xiàn)象，VANNEMREDDY等［3］研究124例非裔美國早產(chǎn)兒，結(jié)果提示T786C基因多態(tài)性是PIVH的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；一項(xiàng)來自波蘭波茲南醫(yī)科大學(xué)的研究卻認(rèn)為T786C多態(tài)性與PIVH無關(guān)，而G894T多態(tài)性才是PIVH的高危因素［18］。不僅是人種不同而造成研究結(jié)果不同，DEMIRCUBUK等［19］研究結(jié)果顯示不同性別相同基因型患者患病率也不一樣，其研究對象為127例胎齡＜37周的土耳其患兒，測定rs1799983多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)男性TT基因型和女性GG基因型更容易發(fā)生RDS。

本研究入選的患兒均為漢族，且祖籍均為河南北部，rs2070744和rs1799983基因型和等位基因頻率與Ensembl數(shù)據(jù)庫中的CHB、CHS已知資料比較［9-10］，均無明顯差異，說明本研究入選對象具有代表性，研究結(jié)果具有普遍意義。同時(shí)也說明取臍帶血測定新生兒基因多態(tài)性這種方法是可行的。本研究結(jié)果提示rs2070744 TC+CC基因型為發(fā)生BPD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），雖然單因素方差分析提示rs1799983 GT+TT基因型增加了BPD的發(fā)生率，但多因素Logistic回歸分析提示其并不是發(fā)生BPD獨(dú)立危險(xiǎn)因素。佛羅倫薩卡雷吉大學(xué)醫(yī)院的研究結(jié)果與本研究不同，其認(rèn)為rs2070744 TC+CC和rs1799983 GT+TT基因型均是BPD的高危因素［4］，其研究對象為342例胎齡≤28周的白種人早產(chǎn)兒，研究對象標(biāo)準(zhǔn)的不同可能是結(jié)果不同的原因。本研究中eNOS基因的3種單核苷酸多態(tài)性均不是ROP Ⅲ～Ⅴ期的高危因素，而rs61722009 aa+ab基因型和rs1799983 GT+TT基因型同時(shí)存在時(shí)，ROPⅢ～Ⅴ期發(fā)生率明顯增高（P＜0.05），與國外的研究有所不同［16-17］。至于需要行有創(chuàng)機(jī)械通氣治療的RDS、PIVHⅢ～Ⅳ級、NEC，均與這3種單核苷酸多態(tài)性無關(guān)。

本研究結(jié)果提示測定eNOS基因多態(tài)性有助于評估早產(chǎn)兒主要并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，有助于臨床上精準(zhǔn)醫(yī)療方法的選擇。同時(shí)，既往作為醫(yī)療廢物的臍帶血可以充分利用，尤其是對于可能患多種并發(fā)癥的早產(chǎn)兒來說，更具有可利用的價(jià)值。該研究的不足之處在于樣本量稍小，其結(jié)果仍需要不同人群更大樣本量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持。

作者貢獻(xiàn)：常紹鴻進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，文章的可行性分析，文獻(xiàn)/資料收集、整理，撰寫論文；常紹鴻和張衛(wèi)星進(jìn)行論文的修訂和英文的修訂；欒斌負(fù)責(zé)文章選題指導(dǎo)、質(zhì)量控制及審校、監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。

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