綠豆皮黃酮的純化工藝研究

周俊鵬，陸鵬飛，倪新雨，郭麗萍，吉義平

（武漢設計工程學院食品與生物科技學院，湖北武漢 430205）

綠豆皮，是綠豆芽、綠豆糕和粉絲等產品生產過程中的副產物，一般較多地被加工成飼料等初級產品，二次開發(fā)利用較少。事實上，綠豆皮中除含有50%左右纖維素[1]外，還有豐富的黃酮類物質、多酚、生物堿等天然活性成分[2]，其中黃酮類因具有改善心血管系統(tǒng)、抗氧化、抗腫瘤及降血糖等多種生理活性而備受關注[3]。目前對綠豆皮黃酮類物質提取的報道較多，而有關綠豆皮黃酮純化工藝的研究相對較少[4-6]。

黃酮類物質的純化方法主要有膜分離法、柱層析法、高速逆流色譜法等，其中柱層析法分離效率高、操作簡單、應用最為廣泛。最常見的柱層析吸附劑有大孔樹脂和聚酰胺。大孔樹脂理化穩(wěn)定性高、再生性強，對有機物選擇性好，其中的多孔網狀結構及表面的極性基團可與黃酮類物質中酚羥基形成氫鍵等作用力而表現出較好的吸附效果，在黃酮類物質的純化應用中較多。任順成等人[7]研究了大孔樹脂對玉米須類黃酮的吸附分離特性，發(fā)現AB-8型樹脂對玉米須類黃酮具有較好的吸附和解析效果；胡志軍等人[8]研究了研究D-101型大孔吸附樹脂分離純化橘皮黃酮類物質的工藝條件；吳海霞等人[9]考查了AB-8，D-101，HPD-100型3種大孔樹脂對銀杏葉黃酮的吸附解析性能，篩選出最佳樹脂AB-8并優(yōu)化出了分離純化銀杏葉黃酮的最佳工藝；朱宏莉等人[10]用X-5型大孔樹脂與聚酰胺樹脂聯用的方法對竹葉總黃酮進行了純化，最終總黃酮含量可達78.97%。關于綠豆皮黃酮的純化未見較多報道，僅有研究分析了NKA-9型大孔吸附樹脂對綠豆皮黃酮的純化工藝，純化后黃酮的純度可由37.14%提高到71.08%。故試驗選擇大孔樹脂法對綠豆皮黃酮的純化工藝進行研究，旨在為綠豆皮的綜合利用及其黃酮的開發(fā)應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

綠豆皮，市售。

鹽酸（分析純），信陽市化學試劑廠提供；氫氧化鈉、硝酸鋁（分析純），天津市凱通化學試劑有限公司提供；亞硝酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司提供；無水乙醇（分析純），天津市天力化學試劑有限公司提供；AB-8型大孔樹脂、LSA-10型大孔樹脂、HPD-100型大孔樹脂、ADS-7型大孔樹脂（分析純），鄭州勤實科技有限公司提供；標準品蘆丁（UV 98%），上海金穗生物科技有限公司提供。

1.2 主要儀器設備

FA1004型電子分析天平，上海越平科學儀器有限公司產品；752型分光光度計，天津市普瑞斯儀器有限公司產品；754PC型紫外可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司產品；SHZ-D（III） 型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司產品；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產品；XFB-200型高速中藥粉碎機，中國吉首忠誠制藥機械廠產品；RE-52A型旋轉蒸發(fā)儀器，上海亞榮生化儀器廠產品；HL-2S型恒流泵，上海滬西分析儀器廠有限公司產品；TS-2102型恒溫搖床，上海天呈實驗儀器制造有限公司產品；FD-1A-50型真空冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司產品；MDF-U73V型醫(yī)用低溫箱，日本松下公司產品；HH-2型數顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 綠豆皮黃酮的提取純化工藝流程

綠豆皮→低溫烘干（60℃） →粉碎→過40目篩→稱取一定量樣品→70%乙醇回流浸提→過濾并定容→黃酮粗提液→大孔樹脂的預處理→上樣吸附→解析→收集解析液→濃縮→冷凍干燥→黃酮粉末。

1.3.2 操作要點

（1） 綠豆皮的前處理。將市售的綠豆皮置于60℃烘箱中烘干至恒質量，用粉碎儀進行粉碎，然后過40目篩，置于干燥器中備用。

（2）綠豆皮黃酮粗提液的制備。用分析天平準確稱取10 g綠豆皮粉置于500 mL的燒杯中，然后按照料液比1∶50加入40%乙醇溶液，將料液轉移至500 mL平底燒瓶中，在70℃的水浴鍋中冷凝回流120 min，最后將得到黃酮粗提液濃縮至1/10體積后定容備用[11]。

（3） 大孔樹脂預處理。先用70%乙醇溶液將大孔樹脂浸泡24 h，待其充分溶脹后裝入層析柱中，然后用5%的鹽酸溶液浸洗樹脂，然后再用5%氫氧化鈉溶液浸洗樹脂，直至流出液不是白色渾濁，再用蒸餾水沖洗至流出液呈中性，最后在50℃的烘箱中烘干至恒質量，然后裝入平皿放入恒溫干燥器中備用。

（4）上樣吸附與解析。通過恒流泵以一定上樣速度、一定上樣濃度、一定上樣量將綠豆皮黃酮粗體液通過裝有一定體積的大孔樹脂的層析柱進行吸附。待達到吸附平衡后，用蒸餾水洗脫除去水溶性雜質，然后以一定濃度、一定流速、一定量的乙醇洗脫液對已飽和吸附的大孔吸附樹脂進行洗脫，收集洗脫液。

（5）黃酮洗脫液的濃縮與干燥。將收集的黃酮洗脫液用旋轉蒸發(fā)儀在40℃，120 r/min條件下進行濃縮，減少到大約為其原有體積的1/50，在醫(yī)用低溫箱中冷凍24 h后置于真空冷凍干燥機中，干燥完全可得到淺黃色的黃酮粉末。

1.3.3 黃酮含量的測定

（1） 標準品蘆丁標準曲線的繪制。用分析天平準確稱取14.5 mg蘆丁標準品置于小燒杯中，加入15 mL 70%乙醇溶液置于40℃水浴中微熱溶解蘆丁標準品，轉移至50 mL容量瓶中，然后用70%乙醇溶液定容至刻度處（0.290 0 mg/mL）。分別吸取標準品0，1.0， 1.5，2.0，2.5，3.0 mL于6個25 mL比色管中，分別加蒸餾水至6.0 mL，再分別加入5%的亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻，放置6 min，加10%的硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加4%的氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度線，搖勻，放置15 min。此時每1 mL中含蘆丁分別為0，0.011 6，0.017 4，0.023 2， 0.029 0，0.034 8 mg。以溶劑作為空白，用分光光度計于波長510 nm處分別測其吸光度，繪制吸光度和蘆丁標準品質量濃度的標準曲線，計算得到線性回歸方程：Y=23.31X+0.013 2，R2=0.999 9。

（2）綠豆皮中黃酮含量的計算。在試驗中用移液管準確吸取提取液體積X（mL），然后根據試驗需要稀釋到V（mL），然后用上述步驟中相同的方法測定吸光度A，再將吸光度A代入線性回歸方程中可計算出稀釋液的質量濃度C（mg/mL），根據公式（1）可計算黃酮溶液的質量濃度。

式中：C——測得的黃酮質量濃度，mg/mL；

25——比色管中定容的體積，mL；

V0——稀釋后黃酮的體積，mL；

V1——取得稀釋后黃酮的體積，mL；

X——稀釋前黃酮的體積，mL。

1.3.4 最佳樹脂的篩選

準確稱取預處理好的4種濕樹脂（AB-8，LSA-10，HPD-100，ADS-7）2.0 g，并將其分別裝入250 mL具塞磨口錐形瓶中，向各瓶中加入50 mL質量濃度C0一定的綠豆皮黃酮溶液，封口后置于恒溫搖床上（溫度4℃，轉速130 r/min）振蕩吸附24 h，在前7 h內，每小時取1 mL吸附液測其吸光度，根據標準曲線計算得到一定時間后吸附液中黃酮的質量濃度C1，根據公式（2） 計算出吸附率Ee；24 h靜態(tài)吸附飽和后，過濾吸附液，再將樹脂浸泡在100 mL 70%的乙醇中，4℃振蕩解析24 h，每1 h取1 mL解析液測其吸光度，根據標準曲線計算得到一定時間后解析液中黃酮的質量濃度C2，根據公式（4） 計算解析率Dd，根據吸附率和解析率篩選出最佳樹脂。吸附率（Ee）、吸附量（Ff）、解析率（Dd）的計算公式如下[12]：

式中：C0——吸附前樣液中黃酮質量濃度，mg/mL；

C1——吸附后上清液中黃酮質量濃度，mg/mL；

C2——解析液中黃酮質量濃度，mg/mL；

V0——樣液的體積，mL；

M——濕樹脂的質量，g。

1.3.5 最佳吸附條件的確定

在室溫條件下，將已經篩選出的最佳樹脂預處理后裝入層析柱（30 mm×400 mm），分別以上樣速度、上樣質量濃度、上樣量為單因素研究綠豆皮黃酮粗提液通過層析柱后流出液中黃酮質量濃度，測得吸附率Ee確定最佳的吸附條件。

1.3.6 最佳解析條件的確定

按照上述最佳吸附條件進行吸附平衡后，先用適量蒸餾水洗去水溶性成分，然后考查不同質量濃度、不同流速、不同量的乙醇洗脫液對已飽和吸附的大孔吸附樹脂進行洗脫，收集洗脫液并測定吸光度，從而得到解析液的黃酮質量濃度，計算解析率Dd，確定最佳的解析條件。

1.3.7 黃酮純度的測定

將預處理好的大孔吸附樹脂裝柱，采用上述最佳吸附和解析工藝條件對黃酮提取溶液進行純化，收集洗脫液，再用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，用真空冷凍干燥機將濃縮的洗脫液干燥至恒質量，稱質量，根據公式（5）公式計算，可以得出綠豆皮黃酮的純度。

式中：C——洗脫液中黃酮的質量濃度，mg/mL；

25——取樣稀釋后的體積，mL；

V——洗脫液的總體積，mL；

X——取樣體積，mL；

M——洗脫液濃縮冷凍干燥后的質量，mg。

2 結果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選結果

2.1.1 4種大孔樹脂靜態(tài)吸附量、吸附率和解析率的對比

4種大孔吸附樹脂的飽和吸附量、吸附率和解析率見圖1。

圖1 4種大孔吸附樹脂的飽和吸附量、吸附率和解析率

AB-8型對綠豆皮黃酮提取液具有最大的飽和吸附量，而另外3種型號大孔樹脂相對較小；從解析率分析可知，AB-8，ADS-7型這2種樹脂的解析率較另外2種大孔樹脂較高，其中AB-8型樹脂解析率最大，PHD-100型解析率小于另外3種；從吸附率分析可知，另外3種大孔樹脂對綠豆皮黃酮的吸附率較AB-8型要差一些。綜合考慮AB-8，LSA-10，PHD-100，ADS-7型4種樹脂的吸附和解析特性可知，AB-8型為純化綠豆皮黃酮較為理想的樹脂。

2.1.2 靜態(tài)吸附和解析動力學曲線

4種樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線（a） 和解析動力學曲線（b） 見圖2。

靜態(tài)吸附動力學曲線反映的是大孔樹脂的吸附量（mg/g） 與吸附時間之間的變化。由圖2（a） 可知，在4 h之前4種大孔樹脂吸附速率快，吸附量變化大；在4 h后AB-8型的吸附量基本不變，到達吸附平衡狀態(tài)，而LSA-10，PHD-100和ADS-7型在5 h后基本達到平衡。由此可見，AB-8型的吸附速率高于另外3種樹脂，并且其吸附量也大于另外3種大孔樹脂。

（a）靜態(tài)吸附動力學曲線

圖2 4種樹脂的靜態(tài)吸附動力學曲線（a）和解析動力學曲線（b）

靜態(tài)解析動力學曲線反映的是大孔樹脂的解析率隨著解析液對已飽和吸附樹脂解析時間的變化趨勢。如圖2（b） 所示，用70%乙醇溶液對4種型號樹脂在恒溫搖床中振蕩洗脫。在5 h內，AB-8到達解析平衡，其解析率增加明顯；5 h后解析率變化不大；LSA-10，PHD-100和ADS-7型在5 h后解析率也趨于平緩，但5 h后AB-8型的解析率大于另外3種大孔樹脂。由此可見，AB-8型的解析率比較好。

綜合以上分析可知，AB-8型具有較好的靜態(tài)吸附和解析動力學特性，因而較適于分離純化綠豆皮黃酮。

2.2 AB-8型大孔吸附樹脂最佳吸附條件的確定

2.2.1 上樣速率對吸附效果的影響

在一定上樣液質量濃度（0.060 4 mg/L） 和上樣量（40 mL）的情況下，將樣品溶液通過恒流泵按照0.61，1.98，2.81 mL/min的流速上樣到層析柱，經過大孔吸附樹脂進行吸附，每流出5 mL流出液測一次吸光度，根據標蘆丁標準曲線計算出黃酮質量濃度（μg/mL），然后以流出液體積為橫坐標、以流出液質量濃度（μg/mL）為縱坐標，繪制出泄漏曲線。以泄漏點（泄漏點是指流出液中的目的產物的質量濃度達到進口的10%時，即為吸附終點）出現最晚上樣流速為最佳[13]。

上樣速率對吸附效果的影響見圖3。

由圖3可知，上樣速率不同，泄漏點出現的時間也不一樣，其中上樣速率為2.81 mL/min時泄漏點出現較早（10 mL），而以速率1.98 mL/min和0.61 mL/min上樣時泄漏點出現較晚（15 mL），在相同的上樣量的條件下，以1.98 mL/min的速度上樣，既能有很好的吸附效果，同時還能夠有效縮短吸附的時間，因此選用1.98 mL/min為最佳上樣速率。

圖3 上樣速率對吸附效果的影響

2.2.2 上樣質量濃度對吸附效果的影響

在上樣速率為1.98 mL/min和上樣量（40 mL）一定的情況下，以不同質量濃度樣品分別上樣，考查上樣質量濃度（mg/mL） 對樹脂吸附率Ee（%） 的影響。

上樣質量濃度對吸附率的影響見表1。

表1 上樣質量濃度對吸附率的影響

由表1可得，當上樣速率恒定，在一定質量濃度范圍內，隨著上樣質量濃度的增大，樹脂吸附率也在不斷增加，當上樣液質量濃度增加到0.049 5 mg/mL時，樹脂達到最大吸附率；此后隨著質量濃度的增加，吸附率不斷的減少；因此該種樹脂的最佳上樣質量濃度為0.049 5 mg/mL；出現這種現象的原因可能是當較高質量濃度的樣液通過樹脂時，樹脂的吸附已經趨向于飽和狀態(tài)。

2.2.3 上樣量對吸附效果的影響

上樣量對吸附率的影響見表2。

表2 上樣量對吸附率的影響

由表2可知，當上樣速率和上樣質量濃度一定時，而上樣量不同時，大孔樹脂的吸附率和上樣量之間存在著一定相關性變化。隨著上樣量的增大，樹脂吸附率也在增大，當上樣量增加到10 mL（2.0 BV）之后吸附率反而下降，這可能是樹脂已經超過了飽和吸附量，導致大孔樹脂發(fā)生部分中毒現象，產生這種現象的原因可能是樣液在樹脂的吸附過程中，上端的樹脂首先發(fā)生吸附作用，此時如果上柱量過多，多層吸附就會在層析柱上端發(fā)生，導致樹脂的吸附率降低，因此最佳上樣量為10 mL。

2.3 AB-8型大孔吸附樹脂最佳解析條件的確定

2.3.1 解析液質量分數對解析效果的影響

解析液質量分數對解析效果的影響見表3。

表3 解析液質量分數對解析效果的影響

由表3可知，在一定的解析液用量和流速下，用不同體積分數乙醇溶液將已飽和吸附的樹脂進行洗脫，樹脂解析率隨著乙醇體積分數的提高而增大；當乙醇體積分數為70%時，樹脂解析率達到最大值76.10%，在此之后樹脂解析率不再出現較大提高，其解析率反而降低，這是因為乙醇體積分數太低，不能破壞樹脂與黃酮形成的氫鍵，黃酮解析率低，隨著乙醇體積分數增大，溶液極性與黃酮極性相差不斷增大，依據相似相溶原理，黃酮的解析率將下降，故最佳解析液質量分數為70%。

2.3.2 解析液流速對解析效果的影響

解析液流速對解析效果的影響見表4。

表4 解析液流速對解析效果的影響

由表4可知，在一定的解析液質量分數和解析液用量下，解析液的流速不同，解析率也不同；當解析液流速為1.98 mL/min時，其解析效果最好，解析率為77.56%，而增大和減少解析液流速都會影響解析效果；這是因為當降低解析液流速時可以使解析液在柱床中停留時間延長，有利于解析液向樹脂顆粒較小空隙擴散，因此適當的降低洗脫液流速，對增強解析效果是有利的，但速率過慢時純化過程耗時長，生產效率就會降低。綜合考慮，故選擇1.98 mL/min為解析液的流速。

2.3.3 解析液用量對解析效果的影響

解析液用量對解析效果的影響見表5。

表5 解析液用量對解析效果的影響

由表5可知，在一定的解析液質量濃度、一定的解析液流速下，解析液的用量不同，解析液用量的增大解析率隨之增大；當解析液用量達到15 mL（5.0 BV）時，大孔樹脂的解析率增長基本趨于平緩，因此考慮到節(jié)約成本，選擇最佳解析液用量為15 mL，同時也便于后面解析液的處理。

3 結論

試驗結果表明，AB-8型樹脂是適用于從綠豆皮中提取黃酮純化的最優(yōu)樹脂。其最佳吸附條件為以流速1.98 mL/min上柱吸附，吸附液質量濃度0.045 9 mg/mL，上樣量10 mL，最大吸附率為88.89%；其最佳解析條件為乙醇體積分數70%，以流速1.98 mL/min洗脫，解析液用量25 mL，解析率為77.23%。在最佳的吸附和解析工藝條件處理綠豆皮黃酮粗提液，黃酮的純度可由10.57%提高到72.19%，效果比較理想，且此法與超濾膜分離、超臨界萃取和色譜分離等方法相比，具有工藝簡便、成本低、條件溫和和生成效率較高等優(yōu)點，對于綠豆皮黃酮的初步純化有較好的推廣應用前景。

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