復(fù)方苦參黃柏溶液經(jīng)氧驅(qū)動(dòng)霧化對(duì)急性創(chuàng)傷修復(fù)模型大鼠EGF、VEGF、TGF-β的影響

竇群立，袁韓濤，黃雅松，申海濱

（1．陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000；2．陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000）

當(dāng)前經(jīng)濟(jì)全球化的高速的發(fā)展，創(chuàng)傷的發(fā)病情況成為心臟病、腦血管病、腫瘤疾病之后，導(dǎo)致人類傷殘甚至死亡第四個(gè)原因[1]。本實(shí)驗(yàn)從傳統(tǒng)中藥聯(lián)合局部氧療治療創(chuàng)傷修復(fù)的思路出發(fā)，結(jié)合傳統(tǒng)中藥與氧療的方法，創(chuàng)新氧驅(qū)動(dòng)中藥?kù)F化局部外治的新型治療方法，實(shí)驗(yàn)研究復(fù)方苦參黃柏溶液氧驅(qū)動(dòng)霧化外治對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)模型大鼠的治療作用，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行初步探討，以期為治療創(chuàng)傷皮膚修復(fù)提供新方法，并為新治療方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠75只，雄性，體重大約在200～250 g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（軍）2012-0007），在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑

復(fù)方苦參黃柏溶液的組成有：苦參30 g、黃柏20 g、蒼術(shù)15 g、艾葉10 g、重樓25 g、花椒12 g。由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，飲片經(jīng)提純加工成每10 mL相當(dāng)于原藥材3.5 g的溶液，由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院制劑中心提制備。康復(fù)新液由四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)有限責(zé)任公司提供。TGF-β、VEGF、EGF試劑盒由上海恒遠(yuǎn)生物工程有限公司提供。

1.3 主要儀器

離心機(jī)，KDC-40（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；酶標(biāo)儀，RT-6000（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；自動(dòng)組織包埋機(jī)，STD-30（德國(guó)萊卡公司）；組織切片機(jī)，KHF-524（德國(guó)萊卡公司）等。

1.4 方法

1.4.1 造模

造模前大鼠背部脫毛、稱重，腹腔注射10%戊巴比妥鈉3.5 ml/kg麻醉后，消毒鋪巾，在脊旁0.5 cm兩側(cè)，各作一個(gè)1.6*1.6 cm2矩形標(biāo)記，切除全層皮膚，止血后用無(wú)菌紗布包扎，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.4.2 分組及換藥

造模完成后，利用隨機(jī)法分組。造模成功后第2天，按文獻(xiàn)方法折算大鼠用藥量[2]。模型組：15只，每天用生理鹽水濕敷創(chuàng)面20 min。中藥組：15只，每天用復(fù)方苦參黃柏溶液濕敷創(chuàng)面20 min。氧療組：15只，每天局部氧療20分鐘。4.康復(fù)新液組：15只，每天用康復(fù)新液濕敷創(chuàng)面20 min。中藥氧療組：15只，每天用氧驅(qū)復(fù)方苦參黃柏溶液霧化創(chuàng)面20 min。霧化步驟：10 ml復(fù)方苦參黃柏溶液加入儲(chǔ)藥罐內(nèi)，通過連接霧化嘴、霧化器儲(chǔ)藥罐、吸入管與氧氣導(dǎo)管作為霧化管道，調(diào)節(jié)氧氣裝置直至儲(chǔ)藥罐有霧化液氣出現(xiàn)，用霧化液氣對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行治療。換藥每天1次，共14天，各組治療完成后用無(wú)菌敷料包扎創(chuàng)面。

1.4.3 取材

對(duì)創(chuàng)面干預(yù)后第3、7、14天。每組5只大鼠，消毒，鋪巾，切除全層皮膚不傷及皮下脂肪及深筋膜，采取標(biāo)本后頸椎脫臼處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。標(biāo)本一部分稱取重量，加入一定量的磷酸緩沖鹽溶液（PBS），備用。使用時(shí)，用勻漿器將標(biāo)本和PBS的混合物研磨充分。用離心機(jī)在轉(zhuǎn)速為2000～3000轉(zhuǎn)/分下保持20 min后移液槍收集上清液等待檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。標(biāo)本融化后仍然保持2～8℃的溫度，使用EGF、VEGF和TGF-β試劑盒進(jìn)行細(xì)胞因子水平檢測(cè)；另一部分放在10%福爾馬林溶液中固定24 h，然后脫鈣48 h備用，后期做石蠟切片。

2 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

2.1 創(chuàng)面組織學(xué)觀察

光鏡觀察創(chuàng)面組織HE染色變化：新生表皮結(jié)構(gòu)完整性，真皮中成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞的分布情況，組織膠原纖維及微血管含量情況。

2.2 EGF、VEGF、TGF-β的含量檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）測(cè)定創(chuàng)面組織中EGF、VEGF、TGF-β的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果運(yùn)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以“±s”表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠創(chuàng)面組織學(xué)大體觀察的比較

通過光鏡觀察創(chuàng)面組織HE染色變化：五組實(shí)驗(yàn)在創(chuàng)面成纖維細(xì)胞數(shù)量及體積、新生毛細(xì)血管、膠原纖維、等指標(biāo)在檢測(cè)的每個(gè)時(shí)期，中藥氧療組各項(xiàng)指標(biāo)明顯強(qiáng)于其余四組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），模型組各個(gè)指標(biāo)最差，其余三組之間各個(gè)指標(biāo)無(wú)明顯差異，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.2 各組大鼠創(chuàng)面組織中TGF-β含量（見表1）

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠創(chuàng)面組織中TGF-β含量的比較（±s）

表1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠創(chuàng)面組織中TGF-β含量的比較（±s）

分組 創(chuàng)面組織中T G F-β含量（p g/m l）3 d 7 d 1 4 d模型組 1 2 8±5.1 5 1 3 4±3.5 7 1 6 8±7.6 7中藥組 1 6 5±6.0 6 2 3 2±4.8 5 2 0 1±3.7 2 8氧療組 1 5 8±2.4 0 2 1 0±7.6 0 1 9 1±8.3 9中藥氧療組 2 0 3±4.1 2 3 1 8±7.5 3 2 2 3±5.3 4康復(fù)新液組 1 6 7±8.5 7 2 4 6±7.6 4 2 1 8±8.7 4

表1可知：用藥后第3天，中藥氧療組、中藥組、康復(fù)新液組分別與模型組相比，創(chuàng)面肉芽組織中TGF-β含量顯著增多，差異均具有顯著性（P＜0.01）；中藥氧療組分別與康復(fù)新液組、中藥組比較，新生創(chuàng)面組織中TGF-β含量明顯增加，差異有顯著性（P＜0.05）；氧療組與模型組相比，新生創(chuàng)面組織中TGF-β含量沒有明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第7天，中藥氧療組、中藥組、康復(fù)新液組分別與模型組相比，創(chuàng)面肉芽組織中TGF-β含量顯著增多，差異有顯著性（P＜0.05）；中藥氧療組分別與中藥組、康復(fù)新液組、氧療組相比，創(chuàng)面組織中TGF-β含量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組、康復(fù)新液組、氧療組創(chuàng)面組織中TGF-β含量比較未見明顯差異（P＞0.05）。第14天，中藥氧療組、康復(fù)新液組、中藥組、模型組比較，創(chuàng)面組織中TGF-β含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3.3 各組大鼠創(chuàng)面組織中EGF含量（見表2）

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠創(chuàng)面組織中EGF含量的比較（±s）

表2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠創(chuàng)面組織中EGF含量的比較（±s）

分組 創(chuàng)面組織中E G F含量（p g/m l）3 d 7 d 1 4 d模型組 3 4 5.6±5.3 8 6 0.4±2.8 8 9 2.2±9.8中藥組 4 7 7.7±5.2 1 2 9 9.4±1 3.3 9 2 8.2±2.7氧療組 3 5 4.8±5.6 1 2 6 7.3±4 3.6 9 2 5.4±6.8中藥氧療組 5 7 9.8±2 2.1 1 6 1 6.4±8.7 9 6 5.6±8.6康復(fù)新液組 4 5 6.5±1 0.2 1 3 2 0.2±9.6 9 2 4.7±2.6

表2可知，用藥后第3天，中藥氧療組、中藥組、康復(fù)新液組分別與模型組相比，創(chuàng)面肉芽組織中EGF含量顯著增多，差異均具有顯著性（P＜0.05）；中藥氧療組分別與康復(fù)新液組、中藥組相比較，新生創(chuàng)面組織中EGF含量明顯增加，差異具有顯著性（P＜0.05）；氧療組與模型組相比，新生創(chuàng)面組織中EGF含量沒有明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第7天，中藥氧療組、中藥組、康復(fù)新液組分別與模型組相比，創(chuàng)面肉芽組織中EGF含量顯著增多，差異均具有顯著性（P＜0.05）；中藥氧療組分別與中藥組、康復(fù)新液組、氧療組相比，創(chuàng)面組織中EGF含量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組、康復(fù)新液組、氧療組創(chuàng)面組織中EGF含量比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。第14天，中藥氧療組、康復(fù)新液組、氧療組、中藥組、模型組兩兩比較，創(chuàng)面組織中EGF含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

3.4 各組大鼠創(chuàng)面組織中VEGF含量（見表3）

表3 不同治療組新生創(chuàng)面組織中VEGF含量比較（±s）

表3 不同治療組新生創(chuàng)面組織中VEGF含量比較（±s）

分組 創(chuàng)面組織中V E G F含量（p g/m L）3 d 7 d 1 4 d模型組 5 3 2.1 4±2 2.6 3 6 4 5.6 5±1 8.4 0 4 8 4.7 1±1 9.0 9中藥組 6 3 0.9 8±1 2.6 7 7 2 5.2 3±1 4.4 1 5 2 2.3 2±6.2 0氧療組 6 1 7.6 0±9.5 9 6 6 2.7 0±1 8.5 8 5 1 9.2 7±1 0.1 1中藥氧療組 6 9 6.8 9±9.2 9 7 7 3.9 9±1 0.3 9 5 6 6.7 0±2 5.3 4康復(fù)新液組 6 4 1.0 2±1 0.8 1 7 1 5.7 4±5.0 1 5 2 7.0 6±1 0.6 5

表3可知，用藥后第3天，中藥氧療組、中藥組、康復(fù)新液組分別與模型組相比，創(chuàng)面肉芽組織中VEGF含量顯著增多，差異有顯著性（P＜0.05）；中藥氧療組分別與康復(fù)新液組、中藥組相比較，新生創(chuàng)面組織中VEGF含量明顯增加，差異具有顯著性；氧療組與模型組相比，新生創(chuàng)面組織中VEGF含量沒有明顯變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第7天，中藥氧療組、中藥組、康復(fù)新液組分別與模型組相比，創(chuàng)面肉芽組織中VEGF含量顯著增多，差異有顯著性（P＜0.05）；中藥氧療組分別與中藥組、康復(fù)新液組、氧療組相比，創(chuàng)面組織中VEGF含量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中藥組、康復(fù)新液組、氧療組創(chuàng)面組織中VEGF含量比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。第14天，中藥氧療組、康復(fù)新液組、氧療組、中藥組、模型組兩兩比較，創(chuàng)面組織中VEGF含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

4 討 論

急性創(chuàng)傷皮膚缺損后，機(jī)體首先進(jìn)入炎癥反應(yīng)階段，此階段由血小板釋放出的EGF、TGF-β等作為炎癥細(xì)胞的趨化劑而發(fā)揮重要作用，復(fù)方苦參黃柏溶液是促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)的有效方劑，臨床應(yīng)用作用突出、療效顯著[3-4]。該方用苦參、黃柏，兩藥性味苦寒，苦能瀉火堅(jiān)陰，寒能清熱涼血，具有清熱燥濕、瀉火解毒、殺蟲止癢之功；蒼術(shù)、艾葉，性味辛、苦、溫，兩藥溫中散寒，開竅配神，化濕辟穢；花椒溫中，逐骨節(jié)皮膚死??；蚤休苦泄解毒。全方寒溫并舉，標(biāo)本兼治，體現(xiàn)了辨證施治的中醫(yī)治療原則。方中各藥藥理作用研究：苦參有抗炎、抗免疫、抗菌作用[5]。黃柏抗菌、抗炎、解熱作用[6]。蒼術(shù)有抗菌、抗炎、抗缺氧作用[7]。艾葉有抗菌、止血、抗炎、抗過敏、鎮(zhèn)痛作用[8]。蚤休：有止血、抑菌、抗炎作用[9]?；ń酚锌咕鷼⑾x、抗凝、抗氧化作用[10]。

復(fù)方苦參黃柏溶液經(jīng)氧驅(qū)動(dòng)霧化這樣給藥主要優(yōu)勢(shì)有：維持創(chuàng)面濕潤(rùn)狀態(tài)、利于毛細(xì)血管的生長(zhǎng)、提高創(chuàng)面的氧分壓、細(xì)胞的分裂和代謝、改善創(chuàng)面的微循環(huán)、增進(jìn)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的吞噬功能、有利于藥物的吸收、加快肉芽組織上皮化速度、減少感染。本實(shí)驗(yàn)說明了：復(fù)方苦參黃柏溶液經(jīng)氧驅(qū)動(dòng)霧化的治療方法是通過增加創(chuàng)面組織中EGF、VEGF、TGF-β的含量達(dá)到促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的作用。急性創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，各個(gè)機(jī)制之間相互作用也難以詳細(xì)闡明，本實(shí)驗(yàn)從單一方面研究，存在一定局限性；實(shí)驗(yàn)受客觀因素限制，未進(jìn)行大樣本實(shí)驗(yàn)，研究時(shí)間段需進(jìn)一步細(xì)化。今后實(shí)驗(yàn)研究工作中，中藥經(jīng)氧驅(qū)動(dòng)霧化治療方法的利用率及治療方式問題有待進(jìn)一步研究提高，發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，為急性創(chuàng)傷修復(fù)的治療開拓新的前景。

[1]張彩珍,王云芳.嚴(yán)重創(chuàng)傷的評(píng)估救護(hù)進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)理論與實(shí)踐,2012,25(20):2496-2497.

[2]施新獻(xiàn).現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,1999:209-211.

[3]竇群立,楊 鋒,劉 波,等.抗感染洗劑治療四肢開放性感染1363例體會(huì)[J].四川中醫(yī),2006,24(3):92-93.

[4]楊 寧,竇群立.抗感染洗劑治療四肢開放性感染1180例療效分析[J].陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2001,24(6):31-32.