結(jié)直腸癌組織中鋅指E盒同源結(jié)合蛋白-1、賴(lài)氨酸酰氧化酶-2的表達(dá)變化及意義

何月新,王斌,穆雅,邊蓮,高立娟

(天津市北辰醫(yī)院,天津300499)

結(jié)直腸癌是消化道常見(jiàn)惡性腫瘤之一。據(jù)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌在所有確診的惡性腫瘤中發(fā)病率高居第三，且結(jié)直腸癌的發(fā)病率有年輕化趨勢(shì)[1]。結(jié)直腸癌的治療手段除傳統(tǒng)外科手術(shù)切除外，近年化療、放療、靶向治療等方法陸續(xù)用于臨床，但目前仍以外科手術(shù)切除為主[2]。隨著影像技術(shù)、內(nèi)鏡檢查及檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，全直腸系膜切除術(shù)手術(shù)方式的確立，使結(jié)直腸癌患者手術(shù)切除率可達(dá)75%[3]，但由于較高的復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率，結(jié)直腸癌患者遠(yuǎn)期預(yù)后并不樂(lè)觀。因此探究結(jié)直腸癌組織中腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，從而找到針對(duì)性的防治方法，是改善結(jié)直腸癌患者預(yù)后的重要手段。鋅指E盒同源結(jié)合蛋白-1(ZEB1)作為鋅指蛋白的一種，參與調(diào)控機(jī)體的胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化過(guò)程[4]。研究[5]發(fā)現(xiàn)，ZEB1在多種惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，且與腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)密切相關(guān)。賴(lài)氨酸酰氧化酶-2(LOXL2)屬于賴(lài)氨酰氧化酶(LOX)家族，能夠通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[6]。本研究利用免疫組化法檢測(cè)ZEB1與LOXL2的表達(dá)情況，結(jié)合患者臨床資料及術(shù)后隨訪結(jié)果，以探究ZEB1、LOXL2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)變化及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取天津市北辰醫(yī)院2010年1月～2017年1月收治的結(jié)直腸癌患者83例，均經(jīng)病理檢查確診。取病理科結(jié)直腸癌患者癌組織及對(duì)應(yīng)的癌旁組織存檔蠟塊83例份。納入標(biāo)準(zhǔn)：癌組織、癌旁組織的石蠟標(biāo)本保存完整且一一對(duì)應(yīng)；臨床病歷資料完整；術(shù)前未經(jīng)放、化療等其他抗腫瘤手段治療；未合并其他嚴(yán)重疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者臨床病歷資料缺失或石蠟標(biāo)本缺失；合并其他惡性腫瘤；合并其他影響免疫組化結(jié)果的疾?。恍g(shù)前已經(jīng)放、化療等其他抗腫瘤手段治療；失訪。其中患者男44例，女39例；年齡34～71(57.31±11.09)歲，<65歲53例，≥65歲30例；經(jīng)病理科確認(rèn)，組織分化程度高者30例，中、低程度者53例；TNM分級(jí)Ⅰ、Ⅱ級(jí)者46例，Ⅲ、Ⅳ級(jí)者37例；浸潤(rùn)程度T1、T2者46例，T3、T4者37例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例，無(wú)轉(zhuǎn)移者45例。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。

1.2 組織中ZEB1、LOXL2表達(dá)的檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)法。將石蠟組織切片，常規(guī)脫蠟、水化，自來(lái)水輕柔沖洗，加入檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(上海士鋒生物科技有限公司)，微波修復(fù)20 min。冷卻至室溫，PBS洗滌，加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑(上海士鋒生物科技有限公司)，PBS沖洗3×3 min。加入一抗(美國(guó)Gene Tex公司)，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，將切片放置至室溫后，PBS沖洗3×5 min，加入聚合物增強(qiáng)劑(Elivision試劑盒A試劑，上海士鋒生物科技有限公司)，室溫孵育20 min，PBS沖洗3×3 min。加入酶標(biāo)抗兔聚合物(Elivision試劑盒B試劑)，室溫孵育30 min，PBS沖洗3×3 min。DAB顯色(上海士鋒生物科技有限公司)，梯度乙醇脫水，常規(guī)中性樹(shù)膠封片。PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。染色結(jié)果判定：本研究結(jié)果由兩位病理科高年資醫(yī)師雙盲法獨(dú)立判定。ZEB1染色定位于細(xì)胞核，LOXL2染色定位于細(xì)胞質(zhì)。取400倍光學(xué)高倍鏡下4個(gè)視野，每個(gè)視野至少含有100個(gè)細(xì)胞，最終結(jié)果取4個(gè)視野評(píng)分的算術(shù)平均值。染色結(jié)果評(píng)分由兩部分組成：染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，黃色至黃棕色計(jì)2分，褐色計(jì)3分；染色數(shù)目計(jì)分：染色細(xì)胞<5%計(jì)0分，5%～25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。最終染色評(píng)分為強(qiáng)度計(jì)分+數(shù)目計(jì)分，≥2分則該組織切片的免疫組化結(jié)果視為陽(yáng)性。

1.3 隨訪 患者出院后，利用電話、電子通訊等手段結(jié)合復(fù)診病歷對(duì)患者及其家屬進(jìn)行隨訪調(diào)查，隨訪截止于2017年12月，時(shí)長(zhǎng)11～62個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為30個(gè)月。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中ZEB1與LOXL2的表達(dá)比較 結(jié)直腸癌組織中ZEB1、LOXL2陽(yáng)性表達(dá)率分別為30.12%(25/83)、75.90%(63/83)，癌旁組織中分別為0(0/83)、13.25%(11/83)，二者比較，χ2分別為29.433、65.932，P均<0.01。

2.2 結(jié)直腸癌組織中ZEB1、LOXL2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中，ZEB1及LOXL2的陽(yáng)性表達(dá)率與患者TNM分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P均<0.05)，與性別、年齡、腫瘤組織分化程度無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 結(jié)直腸癌組織中ZEB1、LOXL2之間的關(guān)系 Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)顯示，結(jié)直腸癌組織中ZEB1與LOXL2的表達(dá)呈正相關(guān)(rs=0.348,P=0.001)。

2.4 結(jié)直腸癌組織中ZEB1、LOXL2表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 將ZEB1/LOXL2陰性組(19例)與ZEB1/LOXL2陽(yáng)性組(24例)患者隨訪結(jié)果制成Kaplan-Meier生存曲線，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，ZEB1/LOXL2陰性組術(shù)后生存率為63.16%(12/19)，生存時(shí)間為(48.37±4.48)個(gè)月，ZEB1/LOXL2陽(yáng)性組患者的生存率16.67%(4/24)，生存時(shí)間(32.50±2.85)個(gè)月，與ZEB1/LOXL2陽(yáng)性組比較，ZEB1/LOXL2陰性組生存率高、生存時(shí)間長(zhǎng)(χ2=8.811,P=0.002；t=14.135,P=0.000)。

表1 結(jié)直腸癌組織中ZEB1、LOXL2表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

圖1 ZEB1/LOXL2陽(yáng)性與陰性組的生存曲線

3 討論

近年，我國(guó)居民由于飲食傳統(tǒng)、構(gòu)成變化，結(jié)直腸癌的發(fā)病率不斷升高，每年約有30萬(wàn)新發(fā)病例[7]，發(fā)病率高居惡性腫瘤第四位，病死率則為第五位[8]。研究[9,10]發(fā)現(xiàn)，相較于原發(fā)腫瘤位置，患者臨床基礎(chǔ)情況、腫瘤的TNM分期、組織分化程度和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素對(duì)患者預(yù)后影響更大，其中TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與其復(fù)發(fā)密切相關(guān)。因此，對(duì)結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)機(jī)制的研究是提高結(jié)直腸癌臨床診療水平、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵因素。

EMT是指上皮細(xì)胞在特定因素影響下，細(xì)胞極性丟失，胞間連接和黏附連接遭到破壞，從而使上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞特性的特殊細(xì)胞，獲得一定的浸潤(rùn)性與游走遷移能力[11]。目前認(rèn)為，EMT不僅與腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，也同時(shí)影響其原位侵襲[12]。一般認(rèn)為，EMT以E-鈣黏蛋白的丟失為主要標(biāo)志[13]。ZEB1能夠通過(guò)抑制E-鈣黏蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，降低腫瘤細(xì)胞間的黏附力，從而促進(jìn)EMT進(jìn)程[14]。近期一項(xiàng)體外研究[15]顯示，siRNA抑制ZEB1表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡增強(qiáng)、遷移受抑制現(xiàn)象。Hanrahan等[16]關(guān)于前列腺癌的研究則顯示，ZEB1在前列腺癌中同樣能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT，從而增強(qiáng)腫瘤的侵襲力，促進(jìn)腫瘤局部浸潤(rùn)與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。在乳腺癌中，ZEB1則通過(guò)沉默Ngn3基因，促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生與惡性進(jìn)展[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，ZEB1在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織中，且與TNM分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等與腫瘤侵襲力相關(guān)的臨床病理參數(shù)相關(guān)，因此可知ZEB1在結(jié)直腸癌中的作用與其他惡性腫瘤中相似，即能夠促進(jìn)腫瘤原位浸潤(rùn)與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。

本研究選擇的另一研究對(duì)象LOXL2同樣是EMT調(diào)節(jié)因子之一，能夠通過(guò)與Snail相互作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞EMT作用[18]，同時(shí)LOXL2還參與細(xì)胞粘連、細(xì)胞遷移作用[19]。LOXL2作為分泌型銅依賴(lài)氨基酸氧化酶的一種，能夠通過(guò)催化特定共價(jià)蛋白的交聯(lián)，起到促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)中膠原質(zhì)與彈性纖維的穩(wěn)定作用，從而影響腫瘤細(xì)胞的生存微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞的遷移與侵襲[20]。本研究結(jié)果表明，LOXL2在結(jié)直腸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率高于癌旁組織，說(shuō)明LOXL2同樣參與結(jié)直腸癌的發(fā)生。結(jié)合患者臨床病理參數(shù)，LOXL2的陽(yáng)性表達(dá)率與TNM分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，表明LOXL2同樣能夠影響結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。

Peng等[21]通過(guò)利用miRNA調(diào)控基因表達(dá)從而發(fā)現(xiàn)肺癌組織中ZEB1對(duì)LOXL2的表達(dá)具有相互促進(jìn)作用，兩者共同作用于腫瘤細(xì)胞EMT。本研究中，肺癌組織中ZEB1與LOXL2的表達(dá)呈正相關(guān)，與此結(jié)果可以互相印證，因此ZEB1與LOXL2在結(jié)直腸癌組織中具有類(lèi)似的協(xié)同作用。本研究統(tǒng)計(jì)隨訪結(jié)果顯示，ZEB1與LOXL2表達(dá)陽(yáng)性的患者預(yù)后差于表達(dá)陰性的患者，表明ZEB1與LOXL2表達(dá)陽(yáng)性預(yù)示患者生存率低與生存時(shí)間短，提示需要對(duì)這類(lèi)患者加強(qiáng)監(jiān)護(hù)。

綜上所述，ZEB1與LOXL2在結(jié)直腸癌組織中過(guò)表達(dá)，且與TNM分期、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此ZEB1與LOXL2可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生與惡性進(jìn)展。ZEB1與LOXL2表達(dá)陽(yáng)性提示患者預(yù)后較差，需要適當(dāng)加強(qiáng)監(jiān)控，合理結(jié)合輔助抗腫瘤手段，從而提高患者生存率，延長(zhǎng)生存時(shí)間。