在不同介質(zhì)中金屬鐵離子對非洛地平片溶出度影響①

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(1.合肥學院分析測試中心, 安徽 合肥 230601；2.合肥華方醫(yī)藥科技有限公司, 安徽 合肥 230088)

0 引 言

1, 4-二氫吡啶(1, 4-dihydropyridines, 1, 4-DHPs)是一類重要的含氮雜環(huán)化合物，多具有生理活性，在生物醫(yī)藥等方面具有廣泛的應用，用于治療高血壓、心絞痛、充血性心衰、局部缺血和動脈粥狀硬化等心血管疾??；在家禽、家畜及水產(chǎn)的養(yǎng)殖上，DHPs具有抗氧化、調(diào)節(jié)機體內(nèi)分泌、促進動物生長、改善機體免疫功能的生物學功能。因其自身的優(yōu)勢，更是作為臨床的一線用藥，使用人群逐漸增多，其所表現(xiàn)出來的副作用也隨之出現(xiàn)，如心動過緩、傳導阻滯、抑制心肌收縮力以及反射性心動過速；非洛地平是二氫吡啶類鈣拮抗劑，容易在光照下氧化降解成吡啶類化合物，具有致畸性和致死性[1～3]。

有關非洛地平體外四種介質(zhì)溶出度報道較多[4～6]，但在實際操作過程中，同一批次產(chǎn)品，在酸性介質(zhì)中不同程度產(chǎn)生氧化降解雜質(zhì)，導致溶出曲線差異較大；而在中性介質(zhì)中不產(chǎn)生氧化降解雜質(zhì)。受到硝酸鈰銨用于硝苯地平含量測定啟發(fā)以及參考相關文獻[7]，發(fā)現(xiàn)在溶出體系中，具有氧化性的Fe3+，在酸性條件下，可將非洛地平迅速氧化，干擾檢測，甚至檢測不到主峰；試驗采用中國藥典2015 年版非洛地平片溶出度測定方法，首次確定取樣針中鐵銹(Fe3+)，在酸性介質(zhì)中將非洛地平氧化產(chǎn)生降解雜質(zhì)，導致溶出曲線差異大，采用peek管取樣可避免上述現(xiàn)象，為今后準確測定非洛地平片體外溶出行為提供參考。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent 1260 液相色譜儀，紫外檢測器(Agilent公司，用于非洛地平片溶出度測定)；AG135 電子天平(梅特勒公司)；FE20 pH計(梅特勒公司)；色譜柱：Thermo ODS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)試劑及試藥：非洛地平對照品(批號100717-201403)、2, 6-二甲基-4-(2, 3-二氯苯基)-3, 5-吡啶二甲酸甲乙酯(非洛地平氧化雜質(zhì)，批號101173-201402)均購自中國食品藥品檢定研究院、非洛地平片(江蘇聯(lián)環(huán)藥業(yè)股份有限公司，2.5mg，批號201760703)，甲醇、乙腈為色譜純，十二烷基硫酸鈉、三氯化鐵為分析純，自制去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo ODS Hypersil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)

流動相：甲醇-乙腈-水(50:15:35)

流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：238nm；進樣量：20 μL；

2.2 溶出度測定法

避光操作。取非洛地平片，照溶出度與釋放度測定法(中國藥典2015版第四部0931第二法)的裝置，以十二烷基硫酸鈉(0.3%)水溶液900 mL為溶出介質(zhì)，轉速為50 r·min-1，依法操作，分別于5、15、30、45min取樣品10 mL，濾過，取續(xù)濾液5 mL作為供試品溶液。同時補加同溫度、同體積介質(zhì)；另稱取非洛地平對照品10mg，精密稱定，置100 mL棕色量瓶，加5 mL甲醇震蕩溶解，并稀釋刻度，搖勻，備用；精密吸取適量，用溶出介質(zhì)配制成每1 mL約含非洛地平2.5μg溶液，作為對照溶液。精密吸取供試品、對照品溶液各20μL，注入高效液相色譜儀中，記錄液相色譜圖，用外標法按峰面積分別計算每片在不同時間點溶出度。

2.3 專屬性考察

避光操作。取非洛地平市售片細粉及非洛地平對照品適量(約相當于非洛地平10mg)，分別置100mL棕色量瓶中，加甲醇溶解、稀釋至刻度，濾過，精密吸取續(xù)濾液5mL，置200mL棕色量瓶中，依次加溶出介質(zhì)稀釋至刻度。精密吸取上述溶液各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。pH1.2鹽酸溶液、pH4.0醋酸鹽緩沖液、pH6.8磷酸鹽緩沖液及水)(均含0.3%十二烷基硫酸鈉)四種介質(zhì)對非洛地平溶出度測定無干擾，表明本方法專屬性良好。

2.4 線性關系考察

避光操作。精密稱取非洛地平對照品約10mg，置100mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液，精密量取對照品貯備液適量，分別制成含0.2585、1.034、1.551、2.068、2.585、3.102μg·mL的各種不同濃度溶液，精密吸取上述線性溶液各20μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以溶液中非洛地平濃度為橫坐標，以相應的非洛地平峰面積為縱坐標作回歸方程，并計算相關系數(shù)。y=2.1×10-6x-70629 r=0.9999(n=6)，表明非洛地平溶液濃度在0.2585μg·mL-1～3.102 μg·mL-1范圍內(nèi)時，非洛地平主峰面積與非洛地平溶液濃度呈良好的線性關系。

2.5 重復性試驗

避光操作。取市售片6片，按“2.2溶出度測定法”項下溶出度測定法操作，在45min取樣，精密吸取續(xù)濾液20 μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計算溶出度的RSD 2.95%，表明該方法重復性良好。

2.6 中間精密度試驗

避光操作。取市售片6片，改變分析人員、分析日期和分析設備，按溶出度測定法操作，在45min時取樣，精密吸取續(xù)濾液20μL，分別注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計算出24片供試品的溶出量及相對標準偏差。結果表明：不同試驗人員，不同時間和不同設備檢測結果的RSD分別為1.92%，符合要求。

圖1

2.7 濾膜吸附性試驗

避光操作。取“2.4”項下質(zhì)量濃度為0.2585、1.034、2.585μg·mL-1的對照品溶液(約相當于溶出量達到10%、40%、100%的濃度)，精密吸取續(xù)濾液5 mL 20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，比較濾膜過濾前后的溶液濃度。另取市售片溶出度試驗45min的供試品溶液同法操作。結果見表1，濾膜對非洛地平吸附率小于2%，表明濾膜過濾后對非洛地平片溶出度測定無干擾吸附。

表1 濾膜吸附性試驗結果

2.8 溶液穩(wěn)定性試驗

取市售片按溶出度測定法操作，分別以pH1.2鹽酸溶液(含0.3%十二烷基硫酸鈉)、pH4.0醋酸鹽緩沖液(含0.3%十二烷基硫酸鈉)、pH6.8磷酸鹽緩沖液(含0.3%十二烷基硫酸鈉)及水(含0.3%十二烷基硫酸鈉)900 mL為溶出介質(zhì)，在5、15、30、45min時取樣，避光室溫放置，分別于0、1、2、4、8h時，精密吸取各20μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，計算各時間點溶出度RSD。結果見表2，表明供試品溶液室溫避光放置8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 耐用性試驗結果

2.9 耐用性試驗

避光操作。取45min溶出液，固定色譜條件，分別改變柱溫、流速、色譜柱型號及流動相比例進行測定，計算該溶出液濃度和RSD。結果見表2，測定結果在色譜條件發(fā)生細微變化時不受影響，顯示該方法耐用性良好。

2.10 不同介質(zhì)中鐵離子對溶出度影響

2.10.1 溶出介質(zhì)的配制

0.1%Fe3+水溶液配制：取三氯化鐵0.1g，置100mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，即得。

0.3%十二烷基硫酸鈉水溶液：取十二烷基硫酸鈉3.0 g，加水溶解并定容至 1000 mL，即得。

0.3%十二烷基硫酸鈉的pH 1.2鹽酸溶液：取十二烷基硫酸鈉3.0 g，加水適量溶解后，加鹽酸7.65mL，再加水稀釋至1000 mL，混勻，即得。

0.3%十二烷基硫酸鈉的pH 4.0醋酸鹽緩沖液：取十二烷基硫酸鈉3.0g，無水醋酸鈉1.22g，加2 mol·L-1醋酸溶液20.5mL，加水溶解并定容至 1000 mL，即得。

0.3%十二烷基硫酸鈉的pH6.8磷酸鹽緩沖液：取十二烷基硫酸鈉3.0g，加0.2mol·L-1磷酸二氫鉀溶液250mL，0.2mol·L-1醋酸溶液112mL，加水溶解并定容至1000 mL， 即得。

2.10.2 溶出結果對比

取市售片按溶出度測定法操作，考察不同介質(zhì)中添加0.1%Fe3+1mL對非洛地平片溶出度影響，結果見表3。

表3 非洛地平片在不同介質(zhì)中溶出度及其降解雜質(zhì)影響

3 結 語

1) 提高測定結果準確性，整個實驗過程中避光操作且涉及的玻璃儀器洗后用EDTA溶液浸泡24h，再用重蒸水洗滌干凈。

2)試驗依據(jù)2015版藥典，對非洛地平片溶出度進行檢測，確定了溶出體系中取樣針中的鐵銹Fe3+，在酸性介質(zhì)將非洛地平氧化，產(chǎn)生降解雜質(zhì)，嚴重影響非洛地平片溶出真實結果；EDTA具有廣泛的配位性能，幾乎能與所有的金屬離子形成螯合物，建議在溶出或檢測體系中添加EDTA-2Na可消除Fe3+的干擾； 由此推測，患者食用含有Fe3+食物后[8]，服用二氫吡啶類藥物，降解雜質(zhì)(二氫吡啶芳構化產(chǎn)物)增加，可影響生物利用度，也可能是二氫吡啶類藥物不良反應較多原因之一。

3)降解雜質(zhì)產(chǎn)生機理推測[7]：

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