黑麥草抗氧化酶對Cd、Zn和Pb復(fù)合污染的響應(yīng)

張 軍，王文科，耿雅妮，任雪盈，王周鋒，曹書苗

（1.長安大學(xué)旱區(qū)地下水文與生態(tài)效應(yīng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710064；2.寶雞文理學(xué)院陜西省災(zāi)害監(jiān)測與機(jī)理模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 寶雞 721013）

土壤重金屬污染，尤其重金屬復(fù)合污染，具有影響范圍廣，持續(xù)時間長，隱蔽性強(qiáng)，不易被發(fā)現(xiàn)且不可逆的特點(diǎn)[1]。植物修復(fù)作為清潔、有效的土壤污染修復(fù)方法，被廣泛應(yīng)用，但是重金屬也會對植物本身造成毒害[2]，導(dǎo)致植物枯萎甚至死亡。植物可以通過自身解毒機(jī)制特別是抗氧化酶系統(tǒng)來減輕這種危害，對于具有一定重金屬富集能力的植物，例如龍葵、東南景天等植物對重金屬表現(xiàn)出很強(qiáng)的耐性和抗性[3-5]。國內(nèi)外研究表明，植物抗氧化酶系統(tǒng)可以清除重金屬產(chǎn)生的活性氧自由基，其中最主要的抗氧化酶是過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）[6]，3種抗氧化酶隨著重金屬種類[7-8]、濃度[9]和植物類型不同[10]，分別表現(xiàn)為激活或抑制作用。在一定重金屬脅迫水平下SOD活性和細(xì)胞內(nèi)的活性氧自由基水平呈正相關(guān)，POD活性與植物體內(nèi)重金屬濃度呈正相關(guān)[11]。

黑麥草（Lolium perenne L.）是我國北方常見的優(yōu)質(zhì)草坪草，種植方便，有很強(qiáng)的再生能力，不僅對多種重金屬有很好的富集能力，而且對重金屬脅迫有很強(qiáng)的耐性和抗性[12-13]。研究表明，黑麥草抗氧化性酶對土壤重金屬污染都有明顯響應(yīng)，單一重金屬污染可以激發(fā)CAT、SOD、POD活性，重金屬復(fù)合污染對酶活性增加具有協(xié)同作用[14-15]。其中，Cd對黑麥草SOD、POD活性都有激活作用，呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢[16]，Pb在低濃度、短時間內(nèi)可以使黑麥草SOD活性明顯升高，但POD活性隨著Pb濃度升高隨之降低[17]。以前的研究多集中在單一重金屬或兩兩復(fù)合重金屬污染上，對多種重金屬復(fù)合污染植物抗性酶響應(yīng)機(jī)制研究較少，因此可以探索利用黑麥草抗氧化酶對重金屬污染的響應(yīng)特征，篩選敏感性指示指標(biāo)來預(yù)報土壤重金屬污染程度[18]。

鑒于重金屬復(fù)合污染在環(huán)境中普遍存在，許多環(huán)境效應(yīng)都無法采用單一污染物機(jī)理來解釋，因此本研究選擇土壤中污染嚴(yán)重的Cd、Zn和Pb作為污染來源，采用復(fù)合和交互正交實(shí)驗(yàn)方法，以黑麥草為實(shí)驗(yàn)生物，研究重金屬復(fù)合污染對黑麥草抗氧化酶活性的影響，以期為土壤重金屬污染植物修復(fù)和污染識別提供理論依據(jù)。

表1 實(shí)驗(yàn)土壤理化性質(zhì)Table1 The physical-chemical properties of the experimental soil

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table2 Design of orthogonal experiment

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

土壤采自陜北延安鐮刀灣地區(qū)黃土，采用多點(diǎn)布設(shè)方法采取0～20 cm表層黃土，裝入密封袋中帶回實(shí)驗(yàn)室風(fēng)干，去除碎石、植物殘根等。然后過20目篩，存放待用。按土壤農(nóng)化的常規(guī)分析法[19]測得土壤的理化性質(zhì)見表1。土壤中重金屬含量采用微波消解-ICPMS（NexION 350X，PE，美國）測定；稱取土壤樣品0.150 0 g，采用 HNO3-HCl-H2O2微波（MDS-10，上海新儀）法消解，同時制作空白，并用標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行校正，同時采用國家標(biāo)準(zhǔn)土樣（GSS-8）進(jìn)行質(zhì)量控制，回收率為97%～103%，RSD≤5%。所有酸均為優(yōu)級純，水為超純水（＞18.2 MΩ）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取3種植物抗氧化酶CAT、POD、SOD為指示指標(biāo)，Cd、Zn、Pb的量和培養(yǎng)時間作為實(shí)驗(yàn)因素，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)因素和水平表（如表2）。Cd、Zn、Pb和時間復(fù)合作用實(shí)驗(yàn)采用L16（45）復(fù)合正交表，3種重金屬交互作用實(shí)驗(yàn)采用L8（27）交互正交表。重金屬指標(biāo)水平設(shè)計(jì)參照土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（GB 15618—2008）和相關(guān)文獻(xiàn)確定[14，16-17]，Cd、Zn、Pb 分別以 CdCl2·2.5H2O、Zn（NO3）2·6H2O 和 Pb（NO3）2配制水溶液的形式加入到土壤中，充分?jǐn)嚢?，平?周后待用，每處理3個重復(fù)。

黑麥草種子先用1%酒精消毒2 min，再用去離子水清洗，然后澆濕放入光照生化培養(yǎng)箱（PGX-450L，寧波賽福），在光照充足恒溫處發(fā)芽。待7 d發(fā)芽后移植到花盆中，每盆保留幼苗30株，每日早晚澆水，保證含水率為田間含水率的60%。1周后施入少量N、P肥，植物發(fā)育吸收后每7 d對植物葉片進(jìn)行采樣，在植物生長期35 d內(nèi)共采樣4次，按照1.3測試方法測試樣品。

1.3 測試指標(biāo)與方法

稱取1.0 g左右新鮮葉片測定抗氧化酶（SOD、POD、CAT）指標(biāo)：參照 Marklund 等[20]測定方法，將葉片放入冷凍缽體中，加入磷酸溶液，在冰浴下研磨成漿，冷凍離心后取酶上清提取液，由抑制劑氮藍(lán)四唑（NBT）在光下還原作用來確定SOD活性，一個酶活性單位由NBT光還原50%來表示；參照Polle等[21]測定方法，用愈創(chuàng)木酚比色法測定POD活性，以1 min內(nèi)470 nm吸光度變化0.01單位來表示酶活性；測量酶上清液240 nm下吸光率的變化速度來反映過氧化氫分解，以1 min內(nèi)減少0.1的酶量為1個酶活單位，用紫外分光光度法（DR6000，HACH，日本）測定CAT活性[22]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用SPSS v22.0進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)方差和差異顯著性分析（Duncan，P＜0.05），采用 Origin8.5 作圖。

表3 L16（45）復(fù)合正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table3 Results of combined orthogonal experiment，L16（45）

2 結(jié)果與分析

2.1 Cd、Zn、Pb復(fù)合作用對黑麥草抗氧化酶活性的影響

由表3可知，在表中16組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中，T6組的CAT活性值最大，T3組的POD活性值最大，T4組的SOD活性值最大。由極差分析可知，各實(shí)驗(yàn)因素對CAT影響順序依次為培養(yǎng)時間＞Cd＞Zn＞Pb；對POD影響順序依次為培養(yǎng)時間＞Pb＞Zn＞Cd；對SOD影響順序依次為培養(yǎng)時間＞Pb＞Zn＞Cd；由此可見，培養(yǎng)時間對植物3種抗氧化酶都是主要影響因素，重金屬Cd對CAT活性有較大影響，Pb對POD、SOD活性有較大影響。

表4中的復(fù)合作用方差分析結(jié)果顯示，3種氧化酶活性對 Cd、Zn、Pb 均無顯著響應(yīng)（P＞0.05）。培養(yǎng)時間對CAT活性有較顯著影響（P＜0.1），對POD活性和SOD活性有顯著影響（P＜0.05）。同時，結(jié)合表3可以得出，CAT對Cd、Zn的方差和較大，對Cd、Zn濃度響應(yīng)較敏感，當(dāng) Cd 為 10 mg·kg-1，Zn 為 150 mg·kg-1的較小濃度時，CAT活性值達(dá)到最大3 731.4 U·min-1·g-1FW，表明低濃度的Cd、Zn對CAT活性具有激活作用；POD、SOD對Pb的方差和較大，表明POD、SOD對Pb較敏感，當(dāng)Pb為500 mg·kg-1，POD活性值達(dá)到最大 2 757.6 U·min-1·g-1FW，當(dāng) Pb 為 900 mg·kg-1，SOD活性值達(dá)到最大1 577.8 U·min-1·g-1FW，表明中濃度的Pb對POD活性具有激活作用，高濃度的Pb對SOD活性具有激活作用。

2.2 Cd、Zn、Pb的交互作用對黑麥草抗氧化酶活性的影響

如表5可知，在交互正交實(shí)驗(yàn)8組數(shù)據(jù)中，S3的CAT活性值最大，S8的POD活性值最大，S4的SOD活性值最大。由極差分析可知，各實(shí)驗(yàn)因素對CAT影響順序依次為 Zn×Pb＞Cd×Zn＞Pb＞Cd×Pb＞Zn＞Cd；對POD 影響順序依次為 Zn＞Pb＞Cd×Pb＞Cd×Zn＞Cd＞Zn×Pb；對 SOD 影響順序依次為 Cd×Zn＞Zn×Pb＞Pb＞Cd×Pb＞Cd＞Zn。

由表 6 中方差分析結(jié)果可知，Cd、Zn、Cd×Zn、Pb、Cd×Pb、Zn×Pb這些因素都對SOD活性有顯著影響（P＜0.05），對CAT活性和POD活性無顯著影響。

表4 L16（45）復(fù)合作用正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table4 ANOVA for combined orthogonal experiment，L16（45）

表5 L8（27）交互作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table5 Results of interaction orthogonal experiment，L8（27）

表6 L8（27）交互作用正交實(shí)驗(yàn)方差分析Table6 ANOVA for interaction orthogonal experiment，L8（27）

2.3 Cd、Pb和Zn主效應(yīng)對黑麥草抗氧化酶活性的影響

重金屬濃度對抗氧化酶活性影響如圖1A～圖1C所示，不同培養(yǎng)時間對抗氧化酶活性影響如圖1D所示。圖1A表明，CAT活性在Cd不同濃度水平均與對照有顯著差異（P＜0.05），在 Cd 濃度為 10 mg·kg-1時酶活性最高，為對照的225%，后隨Cd濃度增加酶活性逐漸降低趨于平穩(wěn)。POD活性在Cd濃度為30、50 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的127%和138%。SOD活性在Cd不同濃度下均比對照值低，在Cd濃度為10、50 mg·kg-1時明顯小于對照（P＜0.05），分別為對照的78%和56%。說明隨著Cd濃度增加，CAT、POD活性逐漸升高，起激活作用，SOD活性總體呈降低趨勢，有明顯的抑制作用。

圖1B表明，Zn濃度在150 mg·kg-1時CAT活性最高，為對照的138%，在550 mg·kg-1時為最低，是對照的71%。POD活性在Zn濃度350 mg·kg-1時最高，為對照的114%，550 mg·kg-1時最低，為對照的78%。SOD活性在Zn濃度150、550 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的191%和206%。說明隨著Zn濃度的增加，總體來看，對CAT、POD活性為先升高后降低，起抑制作用，對SOD先升高然后降低再升高，起激活作用。

圖1C表明，CAT活性在Pb濃度為100、500、900 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的77%、72%和54%。POD活性在Pb濃度為100、500 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的132%和123%。SOD活性在Pb濃度為100、500、900 mg·kg-1時與對照有顯著差異（P＜0.05），分別為對照的49%、70%和149%。說明CAT活性隨Pb濃度升高逐漸降低，起抑制作用，POD活性在低濃度升高，高濃度降低，為先促后抑作用；SOD活性先降低后升高，在高濃度下表現(xiàn)為激活作用。

圖1D表明，從14 d到35 d，CAT和SOD活性隨著時間增長，酶活性一直在升高，起激活作用，CAT和SOD活性在35 d時達(dá)到最高，分別為對照的527.5%和637.4%。對POD活性來說，在第21 d時酶活性下降。在第28 d時酶活性明顯升高，達(dá)到對照的260%，第35 d時酶活性又下降，POD活性隨時間的變化先低后高，隨著時間上下波動并逐漸平穩(wěn)。

3種抗氧化酶和重金屬濃度之間的多元回歸方程如式（1）～式（3）所示。從式（1）～式（3）可得，Cd對CAT、POD、SOD 活性的回歸系數(shù)分別為 141.2、140.2、-81.7，Cd表現(xiàn)為對CAT、POD活性的激活作用，對SOD活性的抑制作用。同理，Zn、Pb表現(xiàn)為對CAT、POD活性的抑制作用，對SOD活性的激活作用。多元回歸方程的分析結(jié)果與以上方差分析結(jié)果相符。

式中：YCAT、YPOD、YSOD分別代表 CAT、POD、SOD 3 種植物抗氧化酶值。

圖1 不同Cd、Pb、Zn濃度及時間對黑麥草3種抗氧化酶活性的影響Figure1 Effect of different cadmium，zinc，lead and time on three antioxidant enzyme activities in ryegrass

3 討論

重金屬污染對植物抗氧化酶的影響已經(jīng)有所報道[23-27]。CAT、POD、SOD抗氧化酶是植物適應(yīng)外部污染脅迫的保護(hù)性酶，在外部重金屬脅迫下可以協(xié)同清除由其產(chǎn)生的活性氧基團(tuán)（Reactive Oxygen Species，ROS），從而保護(hù)植物細(xì)胞不受到破壞[28-29]。在本研究中，單一變異源Cd、Zn、Pb對3種植物抗氧化酶活性影響變化不大，但Zn和Pb相比較Cd來說，對POD活性影響較顯著，當(dāng)Zn濃度為550 mg·kg-1時，POD活性僅比對照下降了21.7%，當(dāng)Pb濃度為900 mg·kg-1時，POD活性僅比對照下降了10.9%，無顯著變化，表明POD在去除Zn和Pb引起的自由基中起主要作用[16]，這與徐衛(wèi)紅等[14]、王晨等[30]的研究結(jié)果一致。本研究中，正交復(fù)合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)下，低濃度Cd、Zn對CAT酶活性具有較大影響，中、高濃度的Pb對POD、SOD酶活性具有較大影響，而培養(yǎng)時間對3種抗氧化酶活性具有顯著影響，隨著培養(yǎng)時間的延長，CAT和SOD活性呈升高趨勢，表明這2種抗氧化酶一直都在起著清除植物體內(nèi)自由基的作用。且在長時間（28 d和35 d）重金屬脅迫下，CAT和SOD都顯著高于對照（P＜0.05），表現(xiàn)為隨時間的激活效應(yīng)。在正交交互實(shí)驗(yàn)中，CAT活性對Zn×Pb、Cd×Zn交互作用最敏感，POD活性對Zn、Pb及Zn×Pb交互作用最敏感，SOD 活性對 Cd×Zn、Zn×Pb 交互作用最敏感，這與單一重金屬脅迫下黑麥草抗氧化酶活性變化有所不同[8，16-17]，表明在復(fù)合重金屬污染下，酶活性并非單一重金屬影響之和，而是表現(xiàn)為協(xié)同或拮抗作用，激發(fā)了植物抗氧化酶長期處于較高水平，防止膜脂過氧化作用而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。重金屬交互明顯增強(qiáng)了CAT、SOD酶活性響應(yīng)，這一結(jié)果可能與黑麥草細(xì)胞解毒機(jī)制以及重金屬之間的交互作用相關(guān)[31]。

植物在重金屬脅迫下，可以通過多種機(jī)制和途徑消除重金屬產(chǎn)生的毒害，特別是通過抗氧化酶清除過量的ROS，達(dá)到解毒的目的[32]。本研究交互實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，重金屬Cd、Zn、Pb復(fù)合污染對SOD活性影響最顯著（P＜0.05），尤其是 Cd×Zn，其次是 Zn×Pb，Zn 的存在可以加大Cd、Pb對植物抗氧化酶的影響，尤其是增強(qiáng)SOD酶活性，這與董冰冰研究黑麥草得出SOD是重金屬耐性敏感指標(biāo)結(jié)果一致[33]。SOD對3種重金屬復(fù)合污染具有明顯的響應(yīng)，這可能是因?yàn)榭寡趸窼OD最先被激活用來去除氧化自由基O-2·，其去除產(chǎn)物H2O2進(jìn)一步被抗氧化系統(tǒng)中CAT、POD轉(zhuǎn)化[34]，因此黑麥草抗氧化性酶SOD對重金屬污染敏感性大于CAT和POD。

4 結(jié)論

（1）Cd、Zn、Pb復(fù)合污染下，黑麥草抗氧化酶產(chǎn)生了不同程度的響應(yīng)。Cd表現(xiàn)為對CAT、POD活性的激活作用，對SOD活性的抑制作用。Zn、Pb表現(xiàn)為對CAT、POD活性的抑制作用，對SOD活性的激活作用。相對于3種重金屬來說，培養(yǎng)時間對CAT、POD、SOD活性影響顯著，特別是對POD活性的影響最大。

（2）在 Cd、Zn、Pb污染脅迫下，SOD 活性對 3種重金屬及其交互作用最敏感（P＜0.05），尤其是Cd×Zn、Zn×Pb共同作用時，因此在黑麥草抗氧化酶中可以選取SOD作為重金屬單獨(dú)或復(fù)合污染程度的指示指標(biāo)。

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