楊樹(shù)舌菌絲體多糖提取條件優(yōu)化研究

陳曉鑫 夏鑫梓 林長(zhǎng)鋒 張 躍 陳 欣 于加平

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院生物工程學(xué)院，吉林 吉林 132101）

樹(shù)舌［Ganoderma applanatum（Pers.Ex Wallr）Pat.］隸屬于真菌門擔(dān)子菌亞門層菌綱靈芝目靈芝科靈芝屬［1］，又被稱為平蓋靈芝、扁木靈芝、赤色老母菌等，分布于東北、西北、華東、華南、西南各省區(qū)，在我國(guó)資源豐富［2］。野生樹(shù)舌多生于楊、樺、柳、櫟等闊葉樹(shù)的枯立木、倒木和伐樁上［3］。目前對(duì)樹(shù)舌的研究主要集中在其子實(shí)體多糖及人工栽培等方面，而對(duì)運(yùn)用液體深層發(fā)酵技術(shù)得到的菌絲體中的多糖研究卻鮮見(jiàn)報(bào)道。因此，本文以熱水浸提法提取楊樹(shù)舌菌絲體多糖，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量，通過(guò)考察浸提溫度、料液比、pH值和浸提次數(shù)4種影響因素，分別對(duì)其進(jìn)行單因素試驗(yàn)，然后采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化，最終得出楊樹(shù)舌菌絲體多糖最佳提取條件。

1　材料、設(shè)備與試劑

1.1　材料

楊樹(shù)舌菌絲體：經(jīng)過(guò)野生子實(shí)體（采自吉林省通化市二道江區(qū)桃園村）分離，采用液體深層發(fā)酵得到菌絲體，陰干、低溫烘干，粉碎，置于干燥器中備用。

1.2　儀器設(shè)備

ZHJH-C1214C型超凈工作臺(tái)（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），IS-RDS3C型疊加式恒溫振蕩箱（常州萬(wàn)合儀器制造有限公司），UV-9100型紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司），F(xiàn)A1004A型電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），ZW-FX-50L型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（深圳市能易儀器有限公司）。

1.3　試劑

葡萄糖、蛋白胨、瓊脂、碳酸氫鈉（沈陽(yáng)市新化試劑廠），硫酸鎂（含7個(gè)結(jié)晶水）、維生素B1（天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司），氫氧化鈉、鹽酸、無(wú)水乙醇、苯酚（浙江王龍科技有限公司），濃硫酸、丙酮、氯仿（濰坊日興化工有限公司），正丁醇（天津市福晨化工試劑廠），磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司），所述試劑均為分析純。

2　試驗(yàn)方法

2.1　楊樹(shù)舌菌絲體的獲得

將野生楊樹(shù)舌子實(shí)體進(jìn)行菌種分離操作，培養(yǎng)得到斜面母種。將分離得到的菌絲體作為液體菌種培養(yǎng)的原材料，在24℃、150 r/min的恒溫振蕩器中進(jìn)行液體培養(yǎng)10 d后，接入發(fā)酵罐中進(jìn)行液體深層培養(yǎng)，得到菌絲體。

2.2　楊樹(shù)舌菌絲體多糖含量的測(cè)定

2.2.1楊樹(shù)舌菌絲體中多糖的提取與純化。稱取液體深層發(fā)酵中所得的菌絲體粉碎后放入燒杯中，加入相應(yīng)體積的蒸餾水于恒溫水浴鍋中浸提，將提取液離心后，殘?jiān)凑障嗤椒ɡ^續(xù)浸提，煮沸的過(guò)程中需攪拌過(guò)濾。將濾液合并后濃縮至原液的1/2，然后根據(jù)Sevage法去蛋白，經(jīng)離心機(jī)分離，取上清液。于蒸餾水中透析48 h，透析完成后，在提取液中加入95%無(wú)水乙醇（使提取液中醇濃度達(dá)到85%以上），放于4℃冰箱中沉淀48 h。離心分離得到沉淀，將其放入含有無(wú)水乙醇溶液的燒杯中洗2次，再用乙醚、丙酮用同樣的方法各洗2次，最終將得到的楊樹(shù)舌菌絲體多糖放入烘箱中干燥至恒質(zhì)量，置于干燥器皿中備用。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱量25 mg無(wú)水葡萄糖，放于容量瓶中定容至250 mL，使其葡萄糖溶液濃度為0.1 mg/mL。分別移取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其按不同的體積（0.1～0.7 mL）分別加入7只試管中，然后依次加入蒸餾水，使每只試管中的溶液最終體積為1 mL，另取1 mL蒸餾水作為對(duì)照。每只試管加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻并迅速加入濃硫酸5 mL，然后將其放到冷水中進(jìn)行冷卻（放置30 min），待冷卻到室溫后搖勻5 min，在490 nm處測(cè)得吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A=1.029 3C+0.009 6，R=0.999 9。

2.2.3換算因子f的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取2.2.1中所得的楊樹(shù)舌菌絲體精制多糖1 mg，定容至50 mL，使其濃度達(dá)到Cx=0.02 mg/mL。用移液管移取1 mL楊樹(shù)舌菌絲體多糖溶液于試管中，加入5%苯酚溶液1 mL后振蕩混勻，隨即迅速向試管中加入濃硫酸5 mL，將其搖勻后并充分反應(yīng)，放入冷水中待冷卻至室溫后，在490 nm處測(cè)定吸光度值，得A=0.112，帶入回歸方程可得Cf=0.015，得到換算因子f=Cx/Cf=1.33。

2.3　楊樹(shù)舌菌絲體多糖提取的單因素試驗(yàn)

2.3.1不同溫度提取楊樹(shù)舌菌絲體多糖。分別稱取5份等同質(zhì)量菌絲體于燒杯中，并向其中加入等同體積的蒸餾水，于恒溫水浴鍋中浸提2 h，浸提溫度分別設(shè)置為80、85、90、95 ℃和100 ℃，進(jìn)行提取，按2.2.2進(jìn)行測(cè)定。

2.3.2不同料液比提取楊樹(shù)舌菌絲體多糖。分別稱取4份等同質(zhì)量菌絲體于燒杯中，浸提中干粉∶水分別為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（W/V，g/mL），浸提溫度為95 ℃，浸提時(shí)間為2 h，進(jìn)行提取，按2.2.2進(jìn)行測(cè)定。

2.3.3不同pH值提取楊樹(shù)舌菌絲體多糖。稱取4份等同質(zhì)量菌絲體于燒杯中，浸提中料液的pH值分別為5、6、7、8，浸提溫度為95 ℃，料液比為1∶20（g/mL），浸提時(shí)間為2 h，進(jìn)行提取，按2.2.2進(jìn)行測(cè)定。

2.3.4不同浸提次數(shù)提取楊樹(shù)舌菌絲體多糖。用電子天平分別稱取4份等同質(zhì)量菌絲體于燒杯中，95℃下浸提2 h，浸提時(shí)料液比為1∶20（g/mL），pH值為7，進(jìn)行提取，浸提液離心后對(duì)殘?jiān)赐瑯臃椒ㄔ龠M(jìn)行多次提取，按2.2.2進(jìn)行測(cè)定。

3　結(jié)果與分析

3.1　楊樹(shù)舌菌絲體多糖提取單因素試驗(yàn)

3.1.1溫度對(duì)菌絲體多糖提取的影響。按照2.3.1所述方法，測(cè)定不同浸提溫度對(duì)菌絲體多糖含量的影響，如圖1所示。

圖1　不同溫度對(duì)多糖提取的影響

由圖1可知，在其他條件不變的情況下，設(shè)定不同浸提溫度對(duì)多糖進(jìn)行提取，可以得出溫度影響多糖浸出率。隨著溫度的升高，多糖含量逐漸增加。當(dāng)溫度為95℃時(shí)，多糖含量達(dá)到最高峰值；而溫度超過(guò)95℃后，多糖的浸出率開(kāi)始減少。由此可知，95℃為楊樹(shù)舌菌絲體的最佳浸提溫度。

3.1.2料液比對(duì)菌絲體多糖提取的影響。按照2.3.2所述方法，測(cè)定不同料液比對(duì)菌絲體多糖含量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2　不同料液比對(duì)多糖提取的影響

由圖2可知，料液比不同，多糖含量存在差異，多糖含量隨著料液比量的增加而增加。當(dāng)料液比由1∶10（g/mL）增大至1∶20（g/mL）時(shí)，菌絲體中多糖含量達(dá)到最高；但當(dāng)料液比量繼續(xù)增加時(shí)，多糖含量卻隨之減少。隨著料液比的不斷增加，所需使用的提取劑蒸餾水的用量也不斷增加，溶解在溶劑中的溶質(zhì)卻不斷減少，后續(xù)濃縮液體所需時(shí)間較長(zhǎng)、效率較低，使得成本與收益相差甚遠(yuǎn)。綜合考慮，料液比選擇1∶20（g/mL）較為合適。

3.1.3pH值對(duì)菌絲體多糖提取的影響。按照2.3.3所述方法，研究不同pH值對(duì)菌絲體多糖含量的影響，如圖3所示。

圖3　不同pH值對(duì)多糖提取的影響

由圖3可知，在其他條件不變的情況下，設(shè)定不同pH值對(duì)多糖進(jìn)行提取，可以看出pH值影響著多糖含量。隨著pH值的變化，溶液由酸性變?yōu)閴A性，多糖含量隨即發(fā)生變化。當(dāng)pH值為7時(shí)，多糖含量達(dá)到最高峰值。而當(dāng)pH值繼續(xù)增加時(shí)，多糖含量卻開(kāi)始下降。因此，pH值為7較為合適。

3.1.4浸提次數(shù)對(duì)菌絲體多糖提取的影響。按照2.3.4所述方法，研究不同提取次數(shù)對(duì)菌絲體多糖提取率的影響，如圖4所示。

圖4　不同浸提次數(shù)對(duì)多糖提取的影響

由圖4可知，在其他條件不變的情況下，只考慮浸提次數(shù)對(duì)多糖含量的影響。由浸提次數(shù)1次變?yōu)?次時(shí)，多糖含量明顯增加2倍，但當(dāng)浸提次數(shù)繼續(xù)不斷增加時(shí)，多糖含量呈現(xiàn)緩慢增加的趨勢(shì)。由此可知，浸提次數(shù)是提取多糖時(shí)的一個(gè)重要影響因素。如果提取次數(shù)過(guò)少，楊樹(shù)舌菌絲體中的多糖不能完全被提取出來(lái)，無(wú)法得到較多的多糖，造成原材料與試劑的浪費(fèi)，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)效益降低。而提取次數(shù)過(guò)多，無(wú)異于增大了浸提液的體積，使得后續(xù)濃縮處理、醇沉等步驟增加時(shí)間，降低試驗(yàn)效率。綜合考慮，選擇合適的浸提次數(shù)對(duì)于多糖提取工藝是至關(guān)重要的。因此，浸提次數(shù)選擇2次。

3.2　楊樹(shù)舌菌絲體多糖提取條件優(yōu)化

根據(jù)楊樹(shù)舌菌絲體多糖提取單因素試驗(yàn)結(jié)果，可選取適當(dāng)?shù)囊蛩嘏c水平，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)行3次重復(fù)，對(duì)楊樹(shù)舌菌絲體多糖提取條件進(jìn)一步優(yōu)化。表1為正交試驗(yàn)因素水平對(duì)照表，表2為正交試驗(yàn)結(jié)果。

由表2結(jié)果可知，不同組合的多糖含量各不相同，存在一定的差異。根據(jù)極差R數(shù)值的大小對(duì)楊樹(shù)舌菌絲體多糖提取條件的影響因素進(jìn)行主次排序，依次為D＞A＞C＞B，選取合適的水平組合為A2B2C2D2，由此可得出當(dāng)浸提溫度為95℃，料液比為1∶20，pH值為7，浸提次數(shù)為2時(shí)，是楊樹(shù)舌菌絲體多糖的最佳提取工藝條件。以最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，此時(shí)的提取率高達(dá)113.4 mg/g。

表1　正交試驗(yàn)因素水平表

表2　正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果

4　結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，楊樹(shù)舌菌絲體最佳提取工藝條件是浸提溫度為95℃，料液比為1∶20，pH值為7，浸提次數(shù)為2次，此時(shí)多糖含量可達(dá)113.4 mg/g。本文通過(guò)對(duì)液體深層培養(yǎng)獲得的楊樹(shù)舌菌絲體，采用熱水浸提法對(duì)其多糖提取有著較為穩(wěn)定的效果，而且此工藝提取過(guò)程簡(jiǎn)單、測(cè)定方法簡(jiǎn)便，成本較低，可用作此類真菌多糖的提取工藝，可為楊樹(shù)舌多糖實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，推動(dòng)楊樹(shù)舌多糖的開(kāi)發(fā)與利用。