三七總皂苷微乳對帕金森模型小鼠行為學(xué)及紋狀體多巴胺含量的影響*

任 靜 ，吳玉梅 ，馬 麗 ，常夢春 ，劉勃纓 ，張麗娜 ，劉志東

帕金森病是主要發(fā)生于中老年人群的一種神經(jīng)退行性疾病。臨床癥狀以靜止性震顫、運動遲緩、肌張力增高和姿勢平衡障礙為主要特征，嚴(yán)重影響患者的運動和生活能力，并可導(dǎo)致殘障。其發(fā)生機理可能與黑質(zhì)-紋狀體中多巴胺（DA）含量減少有關(guān)，治療該病的基本原則是提高大腦黑體中DA的含量[1]。

三七[2]為五加科植物三七[Panax notoginseng（Burk．）F.H.Chen]的干燥根和根莖，主產(chǎn)于中國滇桂西南部，始載于《本草綱目》，有“參中之王”的美譽。三七總皂苷（PN S）為三七的主根或根莖加工制成的總皂苷，是三七的主要成分之一，在治療心腦血管疾病方面具有確切的療效[3]，但其口服易受胃腸道環(huán)境破壞，生物利用度低，油包水型微乳[4]將親水性藥物包載后，可顯著提高藥物的小腸黏膜透過性，保護(hù)藥物免受胃腸道酶的降解，增加藥物吸收，可提高藥物的生物利用度。因此筆者將三七總皂苷制備成W/O型微乳，觀察其對帕金森模型小鼠的治療作用。

1 材料

1.1 儀器 行為學(xué)設(shè)備（SCIForced SwimVersion2.0，SCITail Suspension Version2.0）；高效液相系統(tǒng)熒光檢測器（島津，型號：RF-10AXL），XP205十萬分之一天平（METTLER TOLEDO）；勻漿機（上海弗魯克流體機械制造有限公司）；離心機（Thermo Fisher Scientific）；-80℃冰箱（Haier超低溫保存箱），ATS高壓均質(zhì)機（ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司）。

1.2 試劑 1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）（美國 Sigma公司 SLBS2977V）；生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司1611280721）；高氯酸，檸檬酸（源葉生物Z14M8Y30915），乙酸鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司20150731），1-庚烷磺酸鈉（源葉生物G25M8L32588），三乙胺（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所20150401），乙二胺四乙酸二鈉（源葉生物Z04M8Y30614），L-半胱氨酸（上海藍(lán)季生物150228），磷酸二氫鉀（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司20150504），鹽酸多巴胺（中國食品藥品檢定研究院100070－201507），三七總皂苷原料藥（云南玉溪萬方天然藥物有限公司，批號021108，R1，Rg1和Rb1質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為13.79%、47.26%、24.55%），大豆磷脂[SP，上海艾韋特（A.V.T.）醫(yī)藥科技有限公司SY－SI－170103]，油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944CS，法國佳法賽公司），乙醇為色譜純。標(biāo)準(zhǔn)品溶劑為0.01 mol/L高氯酸、0.50 mmol/L Na2EDTA、0.1 g/L L－半胱氨酸的混合水溶液。組織裂解液為0.60 mol/L 高氯酸、0.50 mmol/L Na2EDTA、0.1 g/L L－半胱氨酸的混合水溶液。高氯酸沉淀劑為1.20 mol/L K2HPO4、2.00 mmol/LNa2EDTA的混合水溶液。

1.3 實驗動物 C57BL/6小鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2016－0011。動物室溫度：（25±2）℃，相對濕度：（50±2）%，相關(guān)研究遵照動物實驗原則進(jìn)行。

2 實驗方法

2.1 PNS微乳的制備 PNS微乳各處方組成為：油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M 1944C S，58%）、大豆磷脂（SP）/乙醇（K m=1，25%）、P NS溶液（400 mg/mL，17%）。按處方量稱定油相、乳化劑與PNS水溶液于燒杯中，50℃恒溫條件下攪拌均勻，依次經(jīng)分散機分散3 min，高壓均質(zhì)機800 bar壓力下均質(zhì)5次，即得PNS微乳[5]。

2.2 動物分組及給藥 實驗選用24只C57BL/6小鼠，自由飲水、取食，于實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。按隨機數(shù)字表法隨機分為4組，即對照組、模型組，PNS微乳及溶液給藥組，每組6只，模型組腹腔注射MPTP[30 mg/（kg·d）]連續(xù)注射5 d，對照組腹腔注射等量生理鹽水，給藥組于造模過程的第3天提前給予PNS微乳及溶液（100 mg/kg），1 h后腹腔注射MPTP[30 mg/（kg·d）]，直到造模結(jié)束；模型組及正常組每天在給藥后進(jìn)行行為學(xué)評價，PNS微乳及溶液組在最后1次給藥后進(jìn)行行為學(xué)評價，檢測藥物對實驗動物肢體運動協(xié)調(diào)功能、紋狀體多巴胺含量的影響。

2.3 PNS微乳對帕金森病小鼠肢體運動功能的影響

2.3.1 爬桿實驗 實驗選取一根長80 cm，直徑1 cm的金屬桿，外部纏繞紗布以防打滑，底部固定在鐵架臺上。將受試小鼠頭向下放于金屬桿頂端，記錄小鼠從桿頂爬至桿底的時間，以小鼠后肢離開頂端開始計時至完全接觸底座停止，每只小鼠記錄3次爬桿時間，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，如遇小鼠出現(xiàn)中途停頓或返向攀爬，則重新測量。

2.3.2 懸尾實驗 實驗在行為學(xué)實驗設(shè)備中進(jìn)行，將小鼠尾巴懸掛在掛鉤上，觀察小鼠運動能力，記錄小鼠震顫時間，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.3.3 游泳實驗 實驗在行為學(xué)實驗設(shè)備中進(jìn)行，將小鼠置于水缸中，水溫為25～30℃，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：在受試時間內(nèi)能連續(xù)不斷游泳者記30分；大部分時間游泳僅偶爾漂浮者記25分；漂浮時間占整個受試時間50%以上者記20分；偶爾游泳者記15分；偶爾用后肢游動者并漂浮在一邊者記10分。最后計算得分情況，并作統(tǒng)計學(xué)分析。

2.4 PNS微乳對帕金森病小鼠DA含量的影響

2.4.1 對照品溶液的配制 精密量取鹽酸DA標(biāo)準(zhǔn)品1.12 mg，置于100 mL量瓶中，加標(biāo)準(zhǔn)品溶劑溶解并定容。

2.4.2 供試品溶液的制備 實驗動物斷頭取腦，在冰枕上分離出腦組織紋狀體，于－80℃冷凍保存。按紋狀體∶組織裂解液=1 g∶7.5 mL的比例加入組織裂解液，勻漿，冷凍離心15 min（12 000 r/min）。上清液再離心1次，于－80℃下保存，樣品待測前先低溫解凍，加入等體積的高氯酸沉淀劑，在冰浴中放置 10 min 后，冷凍離心 15 min（12 000 r/min），過0.22μm的濾膜，即得。

2.4.3 色譜條件色譜柱：Angilent C18（5μm，4.6mm×200 mm）；流動相：檸檬酸－乙酸鈉緩沖液：甲醇（pH 3.8）梯度洗脫，0～10 min：5%B，10～15 min：5%～50%B，15～20 min：50%B；激發(fā)波長（EM）：330 nm，發(fā)射波長（EX）：280 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.4.4 方法專屬性 將空白溶液、鹽酸DA對照品溶液及腦組織樣品溶液分別進(jìn)樣后記錄其色譜圖，結(jié)果顯示，在DA出峰位置，空白無干擾，且目標(biāo)峰分離度良好，符合方法學(xué)要求。

2.4.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密移取上述對照品溶液適量，分別稀釋成 448、358.4、224、89.6、44.8、22.4、11.2、5.6 ng/mL系列對照品溶液，以濃度（C）為橫坐標(biāo)X，峰面積（A）為縱坐標(biāo)Y，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=407.84X－1 129.3，r為0.999 9。DA在5.6～448 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.6 精密度實驗 取6份同一樣本腦組織，分別加入含有一定量的DA對照品，按照腦組織的處理方法處理后進(jìn)樣分析。結(jié)果表明，6份腦組織樣品的峰面積RSD（%）為0.96%，符合方法學(xué)要求。

圖1 多巴胺專屬性圖譜

2.4.7 方法回收率考察 取6份已知DA含量的同一腦組織樣品200μL，分別加入同一濃度的對照品溶液，按照腦組織的樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析，計算加樣回收率。結(jié)果平均回收率為97.66%±1.49%，表明該方法回收率良好。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 三七總皂苷微乳對帕金森病小鼠肢體運動功能的影響

3.1.1 爬桿實驗 爬桿實驗主要考察模型小鼠的肢體運動協(xié)調(diào)能力，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，實驗小鼠對爬桿實驗表現(xiàn)為越來越熟練。爬桿所用的時間越短，說明小鼠肢體運動協(xié)調(diào)能力越好。結(jié)果如表1所示，PD模型組小鼠爬桿時間明顯延長，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義差異（P<0.01）；與模型組相比，三七總皂苷微乳及溶液組的爬桿時間均有所改善，但與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

3.1.2 懸尾實驗 懸尾主要觀察小鼠懸尾后的肢體運動情況，模型組能明顯觀察到小鼠肢體的震顫現(xiàn)象，震顫時間越長，說明小鼠肌強直等情況越嚴(yán)重。結(jié)果如表1所示，PD模型組的震顫時間明顯長于對照組，對照組和PD模型組間有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01），三七總皂苷微乳及溶液組震顫現(xiàn)象有所改善，但與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

3.1.3 游泳實驗 游泳實驗可以反映實驗動物的肢體運動協(xié)調(diào)能力，得分越低，小鼠多處于漂浮狀態(tài)，說明小鼠震顫、肌強直等情況越嚴(yán)重，且能觀察到模型組小鼠有震顫現(xiàn)象。結(jié)果如表1所示，對照組和PD模型組的分值有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0．01），三七總皂苷微乳及溶液組游泳現(xiàn)象有所改善，但與模型組相比無統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 三七總皂苷微乳對帕金森病小鼠肢體運動功能的影響（x±s）

3.2 多巴胺含量測定 將各組樣品進(jìn)樣后分析，實驗測得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，數(shù)據(jù)處理采用單因素方差分析，用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果見表2。

表2 三七總皂苷微乳對帕金森病小鼠腦組織多巴胺含量的影響（x±s）

如表2所示，與正常組比較，模型組DA含量顯著下降（P<0.01），PNS微乳及溶液給藥組DA含量顯著升高（P<0.01）；三七總皂苷微乳組與溶液組相比，兩組之間有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.01）。

4 討論

三七總皂苷在心腦血管系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等方面均得到廣泛的應(yīng)用[6]。在心腦血管方面，三七總皂苷具有抗心肌缺血、抗心肌梗死的作用[7-8]、腦缺血保護(hù)作用[9]，抗血栓作用[10]，抗炎[11]、抗氧化[12-13]等作用。梁建慶等[16]采用 6-羥基多巴胺偏側(cè)損毀黑質(zhì)制備PD大鼠模型，研究三七總皂苷治療帕金森的作用靶標(biāo)，結(jié)果表明其作用靶標(biāo)是神經(jīng)行為學(xué)、TH及 DNA mRNA、pro-BDNF陽性細(xì)胞。

在眾多帕金森病動物模型中應(yīng)用最廣泛的是6-OHDA損毀的帕金森大鼠模型和1-甲基-4-苯基－1，2，3，6－四氫吡啶（MPTP）誘導(dǎo)的帕金森小鼠模型，均是研究PD的良好動物模型，兩者存在許多相同點和相異處。兩者有相同的造模機制[17]，都可模擬較好的急性或亞急性模型，但模擬慢性模型情況各異[18]。兩實驗均結(jié)合行為學(xué)、神經(jīng)生化遞質(zhì)等檢測結(jié)果綜合評定模型，但行為學(xué)實驗觀察方法、內(nèi)容和結(jié)果不同，前者造模成功率不穩(wěn)定，存在機械損傷；后者的成功率雖較高，但存在停藥后機體的代償，癥狀可逆[19]。由于小鼠對MPTP的敏感性界于大鼠與靈長類之間，本實驗采用C57BL/6小鼠腹腔注射PMTP復(fù)制PD模型。PD模型小鼠的行為學(xué)改變常常是由多種形式的行為障礙引起的綜合結(jié)果，不能采用一種行為學(xué)指標(biāo)來檢測行為學(xué)的障礙，本研究以爬桿實驗、懸尾實驗、游泳實驗作為檢測動物肢體運動的協(xié)調(diào)能力的指標(biāo)。

DA是哺乳動物中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分泌的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)，與帕金森病的發(fā)生密切相關(guān)。腦內(nèi)紋狀體DA含量極高，約占全腦的70%，當(dāng)多巴胺能神經(jīng)元減少50%時，DA含量降至正常的30%，可導(dǎo)致帕金森氏病的癥狀出現(xiàn)[20-21]。

本研究依據(jù)PD模型制備方法，采用亞急性MPTP腹腔注射C57BL/6小鼠制備PD模型，隨時觀察模型小鼠行為學(xué)的變化，高效液相色譜-熒光檢測法檢測紋狀體組織中DA的含量。實驗過程中觀察到PD模型鼠的震顫、不自主抖動都很明顯，模型組行為學(xué)指標(biāo)與正常組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異，模型的復(fù)制比較成功。給藥組的行為學(xué)變化與模型組比較無統(tǒng)計學(xué)差異，行為學(xué)障礙略有改善，通過腦組織中DA含量的測定結(jié)果可知，造模后PD模型鼠腦組織中的DA含量明顯降低，與正常組相比有統(tǒng)計學(xué)差異；給予PNS微乳及溶液治療后的小鼠，腦組織中DA含量明顯高于PD模型組，與模型組相比有統(tǒng)計學(xué)差異；PNS制劑組與溶液組間有統(tǒng)計學(xué)差異，制劑組DA含量更加接近正常組，提示原因可能是溶液代謝較快，三七總皂苷微乳具有緩釋效果。

因此，PNS微乳對帕金森模型鼠確有治療作用，為后期三七總皂苷微乳的藥動學(xué)及PK-PD研究奠定基礎(chǔ)。

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