Galectin家族成員對HIV-1感染巨噬細(xì)胞凋亡的影響

王永芳，彭卓穎，李　想，叢　喆，薛　婧，魏　強(qiáng)

(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點實驗室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，新發(fā)再發(fā)傳染病動物模型研究北京市重點實驗室，北京　100021)

HIV-1感染機(jī)體后，破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，使感染者喪失抵抗力進(jìn)而引發(fā)全身疾病，最終發(fā)展成為艾滋病。雖然抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法的應(yīng)用顯著改善了艾滋病患者的生存質(zhì)量，但仍無法徹底治愈艾滋病[1]。單核-巨噬細(xì)胞是HIV-1重要的潛伏感染靶細(xì)胞[2-3]，因此誘導(dǎo)單核-巨噬細(xì)胞凋亡對治療艾滋病具有重要意義。半乳糖凝集素家族成員(galectins)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞與細(xì)胞間、細(xì)胞與基質(zhì)間的相互作用、細(xì)胞黏附、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等多種生物學(xué)過程，并且某些成員與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。例如galectin-2、galectin-4誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞凋亡[4]；上皮細(xì)胞的研究表明細(xì)胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)通過COX-2調(diào)節(jié)galectin-7表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)caspase-3、caspase-9活化，促凋亡蛋白Bax、Bcl-xs表達(dá)量升高從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]；Galectin-8誘導(dǎo)1299 cells非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡[6]；Galectin-9誘導(dǎo)T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞凋亡等[7]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)galectin-3通過Endo G的核轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞凋亡[8]，但galectin家族其他成員對HIV-1感染的巨噬細(xì)胞的凋亡影響尚不明確。鑒于文獻(xiàn)報道galectin家族成員中g(shù)alectin-2、galectin-4、galectin-7、galectin-8、galectin-9與細(xì)胞凋亡相關(guān)，本文主要研究了它們對HIV-1感染巨噬細(xì)胞凋亡的影響。

1　材料和方法

1.1　細(xì)胞

人單核細(xì)胞系THP-1來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞中心；人胚腎傳代細(xì)胞系293T來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所。

1.2　主要試劑及儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均購自Gibco公司；DMEM完全培養(yǎng)基購自HyClone公司；Annexin V/7-AAD細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自BD公司；佛波醇肉豆蔻酸酯 (PMA)購自Sigma公司；HIV-1(Clone:11739R5 tropic)全長質(zhì)粒為 NIH惠贈；重組蛋白galectin-2、galectin-4、galectin-7、galectin-8、galectin-9均購自R&D公司；polybrene購自Millipore公司；流式細(xì)胞儀Accuri C6購自BD公司。

1.3　實驗方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

THP-1是懸浮細(xì)胞，培養(yǎng)基為包含10%胎牛血清和2%雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度調(diào)整到每毫升5×105～1×106個，在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3.2不同濃度galectins誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡檢測及分組

取旺盛生長期的THP-1細(xì)胞每孔5 ×105個細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，實驗組為每孔添加終濃度為1.5、3、5、10 μmol/L的galectin-2；1.5、3、5、10 μmol/L的galectin-4；1.5、3、5、7.5、10 μmol/L的galectin-7；0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L的galectin-8；0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L的galectin-9。對照組為不添加galectin家族成員。在37℃、5% CO2孵箱中孵育細(xì)胞6 h，然后獲取細(xì)胞用annexin V/7-AAD染色，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

在96孔板中加入200 μL 0.2% β-乳糖，顯微鏡下觀察待細(xì)胞解聚后吸入流式管中，加入2 mL預(yù)冷的PBS將細(xì)胞洗一遍；加入2 mL預(yù)冷的1×annexin V binding buffer將細(xì)胞洗兩遍；加入100 μL預(yù)冷的1×annexin V binding buffer，然后加入3 μL annexin V和3 μL 7-AAD并輕輕混勻后置于室溫下避光孵育15 min；加入300 μL預(yù)冷的1×annexin V binding buffer，以200目篩網(wǎng)過濾，在1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.3.4PMA刺激單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞

取旺盛生長期的THP-1細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為每毫升1×106個，接種于6 cm無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中。并在其中加入佛波醇肉豆蔻酸酯 (phorbol myristate acetate, PMA)調(diào)整其終濃度為50 ng/mL，培養(yǎng)24～48 h后即可分化為巨噬細(xì)胞。

1.3.5制備HIV-1病毒并用其感染巨噬細(xì)胞

將NIH惠贈的HIV-1全長質(zhì)粒(Clone: 11739 R5 tropic)用陽離子脂質(zhì)體的方法轉(zhuǎn)染進(jìn)入293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后12 h后更換新鮮的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48 h獲取HIV-1病毒懸液。之后以HIV-1病毒懸液∶細(xì)胞培養(yǎng)基=1∶2的比例培養(yǎng)細(xì)胞4～5 d后獲取細(xì)胞。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h需要接種適量293T在6 cm無菌細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使其轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度在80%～90%之間為宜；細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 h需要更換新鮮的培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)；將10 μg HIV-1質(zhì)粒，用稀釋液(0.9% NaCl)稀釋到總體積200 μL，然后輕輕混勻并置于室溫放置；將4 μL VigoFect，用稀釋液(0.9% NaCl)稀釋到總體積200 μL，然后輕輕混勻并置于室溫放置5 min；將稀釋好的VigoFect溶液逐滴慢慢加入到稀釋好的HIV-1質(zhì)粒溶液中，然后輕輕混勻并將所得到的轉(zhuǎn)染工作液置于室溫放置15 min；將所得到的轉(zhuǎn)染工作液逐滴慢慢加入到4 mL 293T培養(yǎng)基中，然后輕輕混勻并在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)；轉(zhuǎn)染后12 h更換新鮮的培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染后48 h獲取病毒懸液，2000 r/min離心10 min后收集上清并分裝凍存；HIV-1感染巨噬細(xì)胞將HIV-1病毒懸液：細(xì)胞培養(yǎng)基=1∶2的比例培養(yǎng)巨噬細(xì)胞并加入助轉(zhuǎn)劑polybrene使其終濃度為10 μg/mL，12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)基時用PBS清洗細(xì)胞2次，24 h后二次感染細(xì)胞，36 h后更換新鮮培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)4～5 d。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測galectin家族成員誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、HIV-1感染的巨噬細(xì)胞凋亡情況

取巨噬細(xì)胞(THP-1-Mφ)、HIV-1感染的巨噬細(xì)胞(HIV-1-THP-1-Mφ)每孔5 ×105個細(xì)胞在96孔板中培養(yǎng)，實驗組為每孔分別添加5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin-4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8、1 μmol/L galectin-9，對照組為不添加galectin家族成員。在37℃、5% CO2孵箱中孵育細(xì)胞6 h，然后獲取細(xì)胞用annexin V/7-AAD染色，上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.4　統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　不同濃度Galectin-2對THP-1細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為(1.84±0.35)%，1.5、3、5、10 μmol/L galectin-2誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡率分別為(2.85±0.38)%、(8.70±0.61)%、(17.83±0.82)%、(87.60±0.46)%。(圖1)

2.2　不同濃度Galectin-4對THP-1細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為(1.97±0.24)%，1.5、3、5、10 μmol/L galectin- 4誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡率分別為(4.13±0.52)%、(9.26±1.66)%、(75.97±0.98)%、(97.63±0.55)%。(圖2)

2.3　不同濃度Galectin-7對THP-1細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為(4.09±0.47)%，1.5、3、5、7.5、10 μmol/L galectin-7誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡率分別為(3.47±0.55)%、(3.76±0.63)%、(4.59±0.78)%、(18.56±0.64)%、(98.08±1.23)%。(圖3)

圖1　不同濃度的galectin-2誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡Fig.1　Apoptosis of THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-2

圖2　不同濃度的galectin-4誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡Fig.2　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-4

圖3　不同濃度的galectin-7誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡Fig.3　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-7

2.4　不同濃度Galectin-8對THP-1細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為(1.73±0.21)%，0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L galectin-8誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡率分別為(1.74±0.20)%、(2.00±0.06)%、(2.39±0.19)%、(4.57±0.21)%、(27.61±1.30)%、(76.15±2.36)%。(圖4)

圖4　不同濃度的galectin-8誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡Fig.4　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-8

2.5　不同濃度Galectin-9對THP-1細(xì)胞凋亡的影響

結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞凋亡率為(3.84±0.35)%，0.1、0.3、0.5、1、3、5 μmol/L galectin-9誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡率分別為(3.90±0.24)%、(8.50±0.16)%、(19.61±0.57)%、(90.43±2.98)%、(98.20±0.31)%、(95.20±0.89)%。(圖5)

圖5　不同濃度的galectin-9誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞凋亡Fig.5　Apoptosis in THP-1 cells induced by different concentrations of galectin-9

2.6　流式細(xì)胞術(shù)檢測Galectin家族成員誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡情況

鑒于上述實驗結(jié)果，當(dāng)galectins濃度太高時，細(xì)胞幾乎會發(fā)生全部凋亡，不利于后續(xù)比較未感染組與HIV-1感染組在處理前后細(xì)胞凋亡的變化。本文選用5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8和1 μmol/L galectin-9作為適宜濃度分別處理未感染與HIV-1感染的巨噬細(xì)胞并檢測其凋亡情況。

針對未感染的單核-巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明，未添加galectin家族成員的巨噬細(xì)胞(THP-1-Mφ)凋亡率為(4.39±0.74)%，5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8、1 μmol/L galectin-9分別誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞(THP-1-Mφ)的凋亡率為(4.78±0.41)%、(7.21±1.46)%、(3.78±1.03)%、(5.88±2.08)%、(8.10±4.13)%。統(tǒng)計結(jié)果顯示，與未添加galectin家族成員的巨噬細(xì)胞相比，5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8及1 μmol/L galectin-9均對巨噬細(xì)胞(THP-1-Mφ)的凋亡作用無顯著性差異(P> 0.05)。(圖6)

圖6　Galectin-2、galectin- 4、galectin-7、galectin-8、galectin-9誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞(THP-1-Mφ)凋亡Fig.6　Apoptosis in macrophages induced by galectin-2, galectin- 4, galectin-7, galectin-8 and galectin-9

2.7　流式細(xì)胞術(shù)檢測Galectin家族成員誘導(dǎo)HIV-1感染的巨噬細(xì)胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡情況

針對HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞，結(jié)果表明，未添加galectin家族成員的HIV-1感染的巨噬細(xì)胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡率為(12.69±1.16)%；5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、7.5 μmol/L galectin-7、3 μmol/L galectin-8、1 μmol/L galectin-9誘導(dǎo)HIV-1感染的巨噬細(xì)胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡率分別為(11.69±0.90)%、(17.45±1.30)%、(32.01±1.30)%、(15.77±1.21)%、(19.27±2.13)%。統(tǒng)計結(jié)果顯示，與未添加galectin家族成員的HIV-1感染的巨噬細(xì)胞相比，5 μmol/L galectin-2、5 μmol/L galectin- 4、3 μmol/L galectin-8及1 μmol/L galectin-9均對HIV-1感染的巨噬細(xì)胞(HIV-1-THP-1-Mφ)的凋亡作用無顯著性差異(P> 0.05)；7.5 μmol/L galectin-7誘導(dǎo)HIV-1感染的巨噬細(xì)胞(HIV-1-THP-1-Mφ)發(fā)生大量凋亡，與對照組相比，差異有顯著性(P< 0.001)。(圖7)

注：與對照組相比，***P < 0.001。圖7　Galectin-2、galectin-4、galectin-7、galectin-8、galectin-9誘導(dǎo)HIV-1感染的巨噬細(xì)胞(HIV-1-THP-1-Mφ)凋亡Note. Compared with the control group,***P < 0.001.Fig.7　Apoptosis in HIV-l-infected macrophages induced by galectin-2, galectin-4, galectin-7, galectin-8 and galectin-9

3　討論

病毒儲存庫的存在是艾滋病難以根治的最大難點，單核-巨噬細(xì)胞是HIV-1感染的一類重要的病毒儲存庫。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)galectin-3通過Endo G的核轉(zhuǎn)移能夠誘導(dǎo)HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡[8]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)7.5 μmol/L galectin-7能夠誘導(dǎo)HIV-1感染的巨噬細(xì)胞發(fā)生大量凋亡，且不會誘導(dǎo)未經(jīng)HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡。在Galectin家族成員誘導(dǎo)HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞凋亡的研究中，我們發(fā)現(xiàn)只有g(shù)alectin-3和galectin-7對于未感染和HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞凋亡存在病毒感染的特異性，而galectin-2、galectin-4、galectin-8和galectin-9并沒有對HIV-1感染發(fā)生特異作用。這一結(jié)果提示了galectin-3和galectin-7能夠識別HIV-1感染后細(xì)胞表面的某些聚糖分子或者識別發(fā)生糖基化改變的表面受體，致使其可以區(qū)分識別未感染和HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞，進(jìn)而啟動病毒感染細(xì)胞下游分子的凋亡信號通路，最終能夠誘導(dǎo)HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡。

我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)高濃度的galectins可能由于毒性較大會造成幾乎全部細(xì)胞發(fā)生凋亡，同時考慮到大劑量galectins的使用濃度不利于臨床應(yīng)用，因此本文中g(shù)alectins的適宜濃度為能使細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡的最低濃度。研究結(jié)果顯示7.5 μmol/L galectin-7對HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞具有凋亡誘導(dǎo)的特異性作用，但其若實現(xiàn)臨床應(yīng)用，仍存在劑量過大等問題，對于galectin-7的最佳臨床應(yīng)用劑量和安全性仍有待大量實驗的檢驗。此外，對于HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞，galectin-7識別的病毒感染特異性作用機(jī)制以及啟動的下游凋亡信號通路研究目前正在進(jìn)行中。綜上所述，galectin-7對HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞凋亡具有重要作用，為清除HIV-1感染的單核-巨噬細(xì)胞提供了新思路，有助于清除部分病毒儲存庫，從而為實現(xiàn)艾滋病的功能性治愈奠定理論基礎(chǔ)。