樹鼩應(yīng)用于病毒感染性疾病動物模型的研究進展

周風(fēng)梅，李潤峰，袁　兵，楊子峰，張榮平，張云輝,*

(1.昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，昆明　650500； 2.云南省第一人民醫(yī)院昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，昆明　650000；3.呼吸疾病國家重點實驗室/呼吸疾病國家臨床研究中心/廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州　510120； 4.昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明　650500)

病毒感染性疾病是我國主要傳染病之一，常見的有艾滋病、病毒性肝炎、流感、狂犬病等。病毒感染性疾病的發(fā)病率很高，約占我國主要傳染病發(fā)病率的50%(發(fā)病率為106.38/10萬，致死率為0.91/10萬)，嚴(yán)重威脅國民健康[1]。病毒感染性疾病的防治需要了解病毒的生物學(xué)特性、病原體感染及致病機理，而動物模型是連接人類疾病基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用的重要橋梁，因此，構(gòu)建靈便有效且與人類有近親關(guān)系的病毒感染模型，對于病毒感染性疾病的防治具有重要意義。目前，在人類病毒感染性疾病研究中已獲得廣泛應(yīng)用的非人靈長類動物模型和嚙齒類動物模型分別存在價格昂貴和疾病模擬性不足等缺陷，因此急需尋求一種更為理想的病毒學(xué)研究動物模型。隨著全基因組解析以后進化地位的確立，樹鼩已被用于多種病毒性疾病動物模型研究并且優(yōu)勢突顯，展示出其作為病毒感染性疾病新型動物模型的巨大潛能。

樹鼩是一種形似松鼠的小型哺乳動物，體重一般不超過300 g，廣泛分布于南亞、東南亞及我國南部[2]。樹鼩與人類在生理學(xué)、分類學(xué)、基因組學(xué)及免疫學(xué)等生理生化特性方面的相似性高于常用的大鼠、小鼠等嚙齒目實驗動物。并且樹鼩還具有個體小、成本低、易操作和可感染多種病毒等顯著優(yōu)點。因此，與其它實驗動物相比，樹鼩是一種較為理想的用于病毒學(xué)研究的動物模型。本文從分類學(xué)、生理學(xué)和免疫學(xué)等生物學(xué)特征方面闡述了樹鼩應(yīng)用于病毒感染性疾病動物模型的優(yōu)勢，并且重點綜述了樹鼩在多種人類病毒感染性疾病模型應(yīng)用中的最新研究進展。

1　樹鼩作為病毒感染性疾病動物模型的生物學(xué)優(yōu)勢

1.1　分類學(xué)

樹鼩與靈長類動物的近親關(guān)系在其全基因組得到解析后才最終確立。樹鼩與其它29種哺乳動物的基因組數(shù)據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析比較表明樹鼩是其中親緣關(guān)系最接近靈長類動物的一種[3]。而對中緬樹鼩和其他14個哺乳類動物(其中包括6個靈長類動物)全基因組中的2117個單拷貝基因的系統(tǒng)發(fā)育比較也表明樹鼩與靈長類物種的親緣關(guān)系更近[4]。此外，樹鼩和嚙齒類動物的蛋白質(zhì)序列與人同源比對發(fā)現(xiàn)樹鼩和人之間的蛋白質(zhì)相似度較嚙齒類動物高，進一步顯示樹鼩與靈長類動物的親緣關(guān)系高于嚙齒類動物。同時，同源比對還發(fā)現(xiàn)樹鼩的一些重要神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)信號通路與靈長類動物具有高度的相似性。樹鼩與靈長類之間親緣關(guān)系的確立，不僅為進一步研究樹鼩提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，更重要的是也為樹鼩將來能夠補充或替代高成本、長周期的非人靈長類實驗動物，成為新型的實驗動物提供了堅實的遺傳基礎(chǔ)。

1.2　生理學(xué)

樹鼩體型小，成年樹鼩130～210 g，新生仔體重8～10 g；在人工繁殖條件下無明顯繁殖季節(jié)，懷孕周期41～45 d，窩產(chǎn)2～6只，哺乳期35 d左右，離乳后約60 d性成熟；出生4～6個月后就可達到成年期[5]。因而，樹鼩體小易繁殖的優(yōu)越生理學(xué)特征表明其作為實驗動物模型的較易操作性。

1.3　免疫學(xué)

1.3.1淋巴細(xì)胞與細(xì)胞因子

目前，已經(jīng)在樹鼩中鑒定出CD4和CD3ε兩種重要的T淋巴細(xì)胞分化分子。CD4作為T細(xì)胞的協(xié)同受體，在抗病毒免疫中具有重要作用。對樹鼩CD4(tCD4)全長序列進行擴增和克隆，發(fā)現(xiàn)樹鼩CD4氨基酸序列與人和獼猴的親緣關(guān)系較近[6]，且其氨基酸序列胞外域和胞內(nèi)域保守性較好，胞外整體結(jié)構(gòu)與人CD4胞外域相似。此外，CD4分子胞內(nèi)域中的KKTCQC基序在T細(xì)胞受體(TCR)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和激活中起重要作用，而在樹鼩CD4 胞內(nèi)域中也有KKTCQC 基序的存在，且該基序在樹鼩和人類之間是保守的。CD3表達于T淋巴細(xì)胞表面可與T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合，參與T細(xì)胞活化的信號傳導(dǎo)。同樣，對樹鼩的CD3ε編碼序列進行了全長擴增和克隆，顯示樹鼩CD3ε蛋白胞內(nèi)域與跨膜域高度保守，且與人和恒河猴CD3ε的親緣關(guān)系較近[7]。特別是樹鼩TCR/CD3復(fù)合物介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的CD3ε細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域也與人類的CD3ε細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域相似。

細(xì)胞因子(cytokine, CK)是由活化的免疫細(xì)胞產(chǎn)生的介導(dǎo)機體炎癥及免疫應(yīng)答反應(yīng)的一類低分子量可溶性蛋白質(zhì)，包括白細(xì)胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)和生長因子(GF)等。其中，干擾素(IFN)是抵抗病毒的第一道防線?；跇潼毜幕蚪M學(xué)，Li等[8]預(yù)測并鑒定出了樹鼩中存在的五種I型IFN亞型(α, β, ω, κ, ε和δ)， II型IFN(γ)和兩種III型IFN(λ1, λ2/3)。除了半胱氨酸位置和N-糖基化數(shù)量的微小差異外，樹鼩IFN-α和IFN-β的預(yù)測結(jié)構(gòu)接近于人類。對樹鼩TNF-α克隆后發(fā)現(xiàn)與人TNF-α相似度高達84.8%[11]。此外，白介素-7(IL-7)在調(diào)節(jié)T細(xì)胞體內(nèi)平衡和克服慢性病毒感染等方面起重要作用[9]。樹鼩轉(zhuǎn)錄本tsIL7-sv2、tsIL7-sv4和tsIL7-sv5的剪接區(qū)域分別與人IL7δ5、IL7δ3/4和IL7δ3/4/5具有同源性[10]。樹鼩與人在免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的結(jié)構(gòu)和功能方面的相似性，為樹鼩作為病毒感染性疾病模型提供了理論基礎(chǔ)。

1.3.2“眼睛”與“橋梁”

模式識別受體(pattern recognition receptor, PRRs)是天然免疫反應(yīng)起始階段識別微生物病原體的 “眼睛”，這些受體通過識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)來抵御病原微生物對宿主的入侵并激發(fā)下游信號通路，從而引發(fā)天然免疫反應(yīng)。在目前已公認(rèn)的四種PRRs 中，Toll樣受體(TLRs)與病毒感染后引起宿主的天然免疫密切相關(guān)。在樹鼩中已鑒定出13種功能性TLR(tTLR1-tTLR13)，系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)樹鼩TLRs的結(jié)構(gòu)不但保守而且與其它哺乳動物的TLRs具有高度相似性。有趣的是，樹鼩感染HCV后，原代肝細(xì)胞中的tTLR2，tTLR3，tTLR4和tTLR8的mRNA轉(zhuǎn)錄物發(fā)生的變化與人感染HCV后肝細(xì)胞中的變化相似，這表明樹鼩與人可能具有相似的HCV感染模式[12]。

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)是免疫應(yīng)答反應(yīng)中呈遞抗原的“橋梁”，有助于T細(xì)胞受體(TCR)的識別并啟動免疫應(yīng)答。研究發(fā)現(xiàn)，樹鼩和靈長類的MHC I類基因結(jié)構(gòu)相似，都有8個外顯子和7個內(nèi)含子。并且除第2、5和6外顯子分別有3 bp、9 bp和3 bp的缺失外，樹鼩其余的外顯子長度與人和恒河猴相同[4]。樹鼩MHC I類基因氨基酸序列對比顯示其半胱氨酸位點、糖基化位點和CD8+T細(xì)胞結(jié)合位點等都非常保守并且與靈長類相同[13]，這表明樹鼩MHC I類分子可能具備MHC分子的經(jīng)典功能。樹鼩與人在PRRs和MHC分子結(jié)構(gòu)和功能上的相似性，顯示出其作為病毒感染性動物模型的巨大優(yōu)勢。

綜上，樹鼩與人在分類地位和進化程度的親緣性，以及樹鼩在諸多病毒相關(guān)免疫因子(如淋巴細(xì)胞、細(xì)胞因子、PRRs及MHC等)與人類之間存在的相似性，體現(xiàn)了樹鼩作為新型病毒感染性實驗動物模型的潛在優(yōu)越性。

2　樹鼩在人類病毒感染性疾病中的應(yīng)用

2.1　肝炎病毒(Hepatitis viruses)

常見的肝炎病毒包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV) 和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)，能夠引起急性和慢性肝炎，并發(fā)展為肝硬化和肝癌等嚴(yán)重的肝臟性疾病，每年大約有80～100萬人因此而死亡。因此，建立一種有效的肝炎病毒感染動物模型，對肝炎病毒的致病性研究及藥物研發(fā)具有重大意義。

2.1.1乙型肝炎病毒(HBV)

2.1.2丙型肝炎病毒(HCV)

黑猩猩是目前為止除人以外唯一對HCV易感的物種。雖然已經(jīng)證實HCV可以在黑猩猩體內(nèi)復(fù)制，且復(fù)制效率和對HCV的免疫應(yīng)答與人體相似，但黑猩猩感染HCV后的肝臟病變較弱，且無慢性肝炎癥狀[20]，阻礙了其在肝硬化和肝細(xì)胞癌致病機理等方面的研究。轉(zhuǎn)基因小鼠通過模仿人的肝臟環(huán)境，使其對HCV易感，但轉(zhuǎn)基因小鼠與人之間的體內(nèi)環(huán)境和病理機制存在本質(zhì)差異，在HCV感染機制方面的研究也有一定的局限。近期研究稱HCV可在樹鼩原代肝細(xì)胞和活體上有效復(fù)制和感染[21]。Zhao等[22]以HCV陽性病人血清感染樹鼩原代肝細(xì)胞后，在肝細(xì)胞及培養(yǎng)上清中檢測到負(fù)鏈RNA，持續(xù)培養(yǎng)兩周后仍可檢測出病毒RNA。Feng等[21]構(gòu)建樹鼩體內(nèi)感染模型，在其肝組織中檢測出了HCV RNA，免疫組化還發(fā)現(xiàn)了4種HCV特異性蛋白(core, E2, NS3/4及NS5A)，同時發(fā)現(xiàn)與人相似的輕微肝炎癥狀。樹鼩原代肝細(xì)胞及活體均可支持HCV有效感染、復(fù)制和傳播，并發(fā)生與人相似的炎癥反應(yīng)，證明樹鼩可作為一種潛在的丙型肝炎動物模型。樹鼩與其它HCV感染常用研究模型的比較具體見表2。

表1　HBV常用動物模型及其優(yōu)缺點

表2　HCV 常用動物模型及其優(yōu)缺點

2.2　單純皰疹病毒(herpes simplex virus,HSV)

單純皰疹病毒是人類容易感染的病原體之一，一經(jīng)感染將終身潛伏在體內(nèi)，而且容易復(fù)發(fā)，嚴(yán)重危害人類健康。目前常用小鼠和家兔等嚙齒類動物來研究HSV感染的致病性[23]，但小鼠和家兔感染的潛伏期與人類不同[24]，且感染HSV后的免疫反應(yīng)與人類也有一定的差異性[25]，因而研究人員試圖建立HSV樹鼩感染模型。Darai等[26]發(fā)現(xiàn)幼齡樹鼩對HSV具有易感性且感染后檢測發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)生嚴(yán)重的病理組織學(xué)變化，出現(xiàn)了類似皰疹肝炎癥狀，肝臟和脾臟可檢測出高滴度的HSV病毒。Li等[24]用HSV-1 17+毒株接種后樹鼩出現(xiàn)了類似于人感染HSV的腦炎癥狀，如：共濟失調(diào)、站立不穩(wěn)、傾斜等異常行為，并在樹鼩腦組織中檢測到了HSV-1 DNA，進一步證實樹鼩對HSV易感。以上結(jié)果說明樹鼩可作為研究HSV感染機制和致病性的潛在動物模型。

2.3　流感病毒(Influenza virus)

流感病毒是一種急性的高傳染性病毒，如甲型H1N1流感病毒、新近暴發(fā)的H7N9流感病毒等，可隨季節(jié)性暴發(fā)流行，給人類的健康和財產(chǎn)帶來了很大的危害。對于流感病毒的動物模型，先前已報道關(guān)于雪貂和小鼠的研究。不過雪貂雖敏感，卻不易獲得；而小鼠必須連續(xù)傳代方可適應(yīng)。樹鼩的人/禽流感病毒受體分布比較接近人，且有較好的行為表象一致性和致病機制同源性。朱宇同等[27]對樹鼩通過鼻腔接種A、B、C三種流感病毒，發(fā)現(xiàn)流感病毒A3型、新A1型或B型可成功感染樹鼩，出現(xiàn)規(guī)律排毒和抗體增加等現(xiàn)象，并且大多數(shù)感染的樹鼩伴隨有上呼吸道感染、體溫曲線不規(guī)律等癥狀。YANG等[28]發(fā)現(xiàn)樹鼩感染H1N1流感病毒后表現(xiàn)出輕度或中度的呼吸道感染癥狀，并在其上呼吸道檢測到了H1N1的復(fù)制，表明樹鼩可感染流感病毒，為樹鼩作為流感病毒研究的實驗?zāi)Ｐ吞峁┝己玫淖糇C。

2.4　腸道病毒(Enterovirus)

腸道病毒EV71是造成兒童手足口病(hand, food and mouth disease, HFMD)的主要病原體之一，會對嬰幼兒的生命健康造成較大的威脅。已有報道，大部分腸道病毒可感染食蟹猴、恒河猴或獼猴等非人靈長類動物，但是感染后的病理癥狀明顯不足。EV71靜脈注射食蟹猴后，感染動物雖然表現(xiàn)出與人感染相似的病毒血癥、震顫、腦水腫以及共濟失調(diào)等典型癥狀[29]，但不會出現(xiàn)發(fā)燒癥狀且即使使用不同毒性的毒株感染食蟹猴也不能觀察到明顯的神經(jīng)毒力作用。 EV71感染恒河猴后雖然引起手足口皮疹癥狀，卻不能引起典型的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀[30]。王文廣等[31]對3個月齡的樹鼩進行EV71感染實驗，發(fā)現(xiàn)其體溫、白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞水平均有升高趨勢；繼續(xù)感染兩周后，部分樹鼩出現(xiàn)了急性松弛性癱瘓，并有尿潴留癥狀，組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)在腦、心、肺、脾、腎等部位伴隨有相應(yīng)的病理變化，表明EV71病毒可感染幼齡樹鼩?？滤_奇病毒(Coxsackievirus, CV) A 組16 型(CA16)屬于小核糖核酸家族的腸道病毒屬, 是人手足口病的另一種主要病原體。在CA16感染獼猴模型的研究中，感染的獼猴手足口部出現(xiàn)了皰疹并伴隨發(fā)熱癥狀，同時觀察到典型的病毒血癥和多種組織病毒載量上升等類似CA16感染人類的臨床癥狀[32]，但其病理變化較弱，且不能夠產(chǎn)生有效的中和抗體反應(yīng)，因而極大阻礙了該模型的廣泛應(yīng)用。李建平等[33]用CA16感染樹鼩后，在其多種器官以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)和糞便中發(fā)現(xiàn)高載量病毒，同時肺、腎等組織中也出現(xiàn)細(xì)胞損傷和炎性細(xì)胞侵潤等病理反應(yīng)，說明樹鼩對CA16具有敏感性，適合發(fā)展為研究CA16的潛在動物模型。

2.5　其他病毒

另外，在基孔肯雅(chikungunya, CHIK)、登革病毒(dengue virus，DENV)及EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)等其它病毒方面也有樹鼩相關(guān)模型的研究?；卓涎挪∈怯蒀HIK病毒引起的一種人獸共患病，主要流行于非洲和東南亞地區(qū)。張海林等[34]用CHIK病毒感染樹鼩后出現(xiàn)了病毒血癥，并產(chǎn)生了高滴度的血凝抑制抗體；此外在腦、肺、肝、脾、腎等內(nèi)臟中檢測到了病毒，并發(fā)現(xiàn)有發(fā)炎和出血現(xiàn)象，表明樹鼩對CHIK 病毒較為敏感，可作為本病毒的實驗動物模型應(yīng)用于有關(guān)研究中。登革病毒屬于黃病毒科(Flavivirade)黃病毒屬(Flavivirus)中的一個血清型亞群，主要通過埃及伊蚊和白蚊伊蚊等媒介傳播，由該病毒引起的登革熱已成為繼瘧疾之后全球傳播最廣的第二大蟲媒疾病。姜黎明在構(gòu)建登革病毒樹鼩模型的研究中，發(fā)現(xiàn)感染樹鼩有發(fā)燒、死亡、病毒血癥和氨基酸轉(zhuǎn)移酶偏高等現(xiàn)象，這些癥狀表明樹鼩可作為DENV的新模型的候選動物，為未來建立成熟的登革熱動物模型提供科學(xué)依據(jù)。EB病毒是皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒屬的成員。在最近報道的EB病毒感染樹鼩的研究中，發(fā)現(xiàn)EB病毒的拷貝量及其抗體都有不同程度的增加，同時觀察到樹鼩肝、脾和腸系膜淋巴結(jié)腫大，此外出現(xiàn)了脾小體增生，在肝臟和腸系膜淋巴結(jié)中有炎性細(xì)胞侵潤等炎癥反應(yīng)[35]，表明樹鼩作為EBV動物模型的潛能。

綜上，樹鼩作為一種新的模式動物，不僅繁殖快、體型小，易操作、成本低，且能夠感染多種與人類疾病相關(guān)的病毒并呈現(xiàn)出與人類感染病毒相似的疾病病程，因而是一種用于病毒學(xué)研究較為理想的動物模型。

3　展望

綜上所述，樹鼩全基因組的解析及分類和進化地位的確立，加之樹鼩與人類有著相似的生理生化及免疫學(xué)等生物學(xué)特性，這都為樹鼩成為研究人類病毒感染性疾病的新型實驗動物奠定了堅實的基礎(chǔ)。但一種實驗動物模型的應(yīng)用，需要建立在清晰的遺傳背景、規(guī)?；姆敝臣胺€(wěn)定的遺傳成分等基礎(chǔ)之上，而這些缺陷也是目前樹鼩在致病機制研究與藥物及疫苗研發(fā)應(yīng)用中遇到的瓶頸。另外，目前市場上針對樹鼩專有的檢測試劑盒仍然十分缺乏，在很大程度上制約了樹鼩在醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域的研究。因此，樹鼩模型研究中的缺陷問題亟需解決。可喜的是，近年來世界上一些國家已經(jīng)開展了樹鼩實驗動物化的研究并取得了一定的進展，我國也正努力建立相應(yīng)的純化品系，使樹鼩的飼養(yǎng)及繁殖規(guī)模化和標(biāo)準(zhǔn)化，并試圖研發(fā)樹鼩專有的特異性檢測試劑盒[36]。因而樹鼩將有望發(fā)展為一種新穎而完善的病毒感染性疾病動物模型，并廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)動物實驗中，尤其在探討人類疾病致病機制和開發(fā)新型治療藥物等方面發(fā)揮更大作用。

參考文獻：