實(shí)驗(yàn)用狨猴微衛(wèi)星引物篩選及遺傳多樣性分析

滕永康，劉先菊，張　旭，向志光，阮研碩，肖　沖，劉云波

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京　100021)

普通綿耳狨猴(Callithrixjacchus)是一種小型的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，原產(chǎn)于南美巴西的熱帶雨林，因具有體型較小(成年狨猴體長(zhǎng)165～199 mm，體重337～413 g[1])、便于捕捉和固定、飼養(yǎng)成本較低、繁殖效率較高等特點(diǎn)，已廣泛用于神經(jīng)科學(xué)、行為學(xué)、傳染病學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)、藥物開(kāi)發(fā)及藥物安全評(píng)價(jià)等研究領(lǐng)域[2-3]。自上世紀(jì)80年代引入我國(guó)以來(lái)，在病毒學(xué)[4-5]、免疫學(xué)[6-7]、基因工程[8-9]等研究領(lǐng)域應(yīng)用較多。清晰的遺傳背景是狨猴實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性、準(zhǔn)確性、可重復(fù)性、以及科學(xué)引種、繁殖和生產(chǎn)的基本保障，而盡快建立狨猴的遺傳質(zhì)量監(jiān)測(cè)體系更是十分必要和亟待開(kāi)展的工作。隨著實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于我國(guó)多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳背景監(jiān)測(cè)和種群遺傳結(jié)構(gòu)分析，如近交系小鼠及大鼠[10]、封閉群小鼠[11]及大鼠[12]、長(zhǎng)爪沙鼠[13]、小型豬[14]等常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群體已建立了穩(wěn)定的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測(cè)方法，包括非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，如恒河猴[15]及食蟹猴[16]，均有相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳學(xué)結(jié)構(gòu)分析報(bào)道。而狨猴作為新型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，國(guó)外研究者Raveendran等[17]、Katoh等[18]相繼開(kāi)發(fā)了狨猴微衛(wèi)星DNA標(biāo)記引物，并對(duì)狨猴微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析報(bào)道，國(guó)內(nèi)至今尚無(wú)報(bào)道。鑒于狨猴在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域諸多學(xué)科的重要性，以及狨猴目前仍作為“實(shí)驗(yàn)用狨猴”，尚無(wú)國(guó)家、行業(yè)或地方標(biāo)準(zhǔn)的推出。本文通過(guò)篩選驗(yàn)證得到20對(duì)多態(tài)性較好的微衛(wèi)星位點(diǎn)，并就中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物北方資源中心引進(jìn)的實(shí)驗(yàn)用狨猴群體遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)定分析，為狨猴科學(xué)繁育及遺傳質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年狨猴30只，年齡2～4歲，體重330～420 g。由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物北方資源中心[SCXK(京)2014-0011][SYXK(京)2017-0027]提供。溫度24℃～29℃，濕度> 40%，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。

1.2　主要試劑及儀器

Easy Pure Blood Genomic DNA Kit(code #EE121-01，全式金)；2×EasyTaq PCR Super Mix(AS111-02，全式金)；100 bp DNA Ladder(code 3422A，TaKaRa)；抗凝劑為乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)；PCR儀(MycyclerTMThermal Cycler型，Bio-Rad)；電泳儀(200/2.0 Power Supply型，Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1600型，天能)；遺傳分析儀(3730XL DNA analyzer，ABI)。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣本采集和基因組DNA提取

狨猴后肢靜脈采血，EDTA-K2抗凝，采血量為每只0.5 mL。用Easy Pure Blood Genomic DNA kit純化基因組DNA。

1.3.2引物篩選及PCR擴(kuò)增

通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，篩選多態(tài)性較好的41個(gè)狨猴微衛(wèi)星標(biāo)記，經(jīng)NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/unists)報(bào)道及PCR優(yōu)化后得到了20個(gè)狨猴微衛(wèi)星標(biāo)記和20對(duì)引物，這些標(biāo)記基因基本覆蓋了狨猴20條染色體上的遺傳概貌，具有豐富的多態(tài)性，微衛(wèi)星標(biāo)記信息詳見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增總體系20 μL，其中2×EasyTaq PCR Super Mix 8 μL，模板DNA量1 μL，上下游引物各0.2 μL(濃度：50 μmol/L)，ddH2O 10.6 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火溫度55℃～60℃ 30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸8 min，擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。

1.3.3PCR產(chǎn)物鑒定及電泳結(jié)果

用2%瓊脂糖凝膠(agrose)電泳，點(diǎn)樣量每孔5 μL，以150 V恒壓30 min進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定；再用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，以80 V恒壓1.5 h進(jìn)行等位基因的分離，上樣量5 μL，用EB緩沖液進(jìn)行染色，Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.3.4STR掃描

一次掃描3個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，每3個(gè)位點(diǎn)的反向引物分別用ROX、FAM、HEX三種熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記后的引物再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物按1∶3∶5體積比混合后取1 μL進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)和遺傳分析儀3730xl DNA analyzer(ABI)掃描分析，通過(guò)Genemarker V2.2.0軟件統(tǒng)計(jì)等位基因片段大小，并對(duì)掃描峰圖進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

群體內(nèi)遺傳結(jié)構(gòu)分析常采用雜合度和多態(tài)信息含量進(jìn)行分析和評(píng)估，將所有樣本的微衛(wèi)星基因型輸入Popgene1.32軟件，計(jì)算不同個(gè)體在各個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上的觀察等位基因數(shù)(observed number of alleles, Na)、有效等位基因數(shù)(effective numbers of alleles, Ne)、表觀雜合度(observed heterozygosity, Ho)、期望雜合度(expected heterozygosity, He)、香隆信息指數(shù)(Shannon’s information index, I)及反映哈迪-溫伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium, HWE)的P-val；再用PIC-CALC軟件(Version- 0.6)對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)信息含量(polymorphism information content, PIC)計(jì)算。

2　結(jié)果

2.1　PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

圖1所示，采用No.3樣本基因組DNA擴(kuò)增的20對(duì)狨猴微衛(wèi)星產(chǎn)物。2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，經(jīng)PCR反復(fù)優(yōu)化，擴(kuò)增產(chǎn)物豐度較高、特異性較好，初步可以觀察到不同微衛(wèi)星標(biāo)記擴(kuò)增片段大小的不同；進(jìn)一步用6%非變形的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，檢測(cè)出各個(gè)微衛(wèi)星不同等位基因的片段大小(圖2)。

2.2　STR掃描結(jié)果

篩選的20個(gè)狨猴微衛(wèi)星標(biāo)記通過(guò)PCR擴(kuò)增，凝膠電泳鑒定豐度較高，初步用非變性聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行分離，顯示出各標(biāo)記位點(diǎn)不同片段大小的等位基因；進(jìn)一步STR掃描后，30個(gè)樣本在20個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記均檢測(cè)到掃描波峰，不同樣本在各位點(diǎn)標(biāo)明有效等位基因大小及數(shù)量(圖3)。STR掃描可以精確到等位基因片段大小1 bp的差異，圖3是樣本1、5、7、12在微衛(wèi)星位點(diǎn)Ham26的掃描波峰，圖3A只檢測(cè)到1個(gè)等位基因波峰，表示樣本為純合子；圖3B～D各檢測(cè)到2個(gè)等位基因波峰，表明所檢樣本均為雜合子。

注：(M)DL1000 bp marker。圖1　20個(gè)狨猴微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)No.3樣本DNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果Note.(M)DL1000 bp marker.Fig.1　The PCR amplification results of 20 marmoset microsatellite markers of the sample No.3

注：(M)DL1000 bp marker。圖2　20個(gè)微衛(wèi)星DNA等位基因片段大小的非變性聚丙烯凝膠電泳分離結(jié)果Note.(M)DL1000 bp marker.Fig.2　The allele size and number results of 20 microsatellite DNA separated by the non-denatured 6% PAGE

2.3　種群遺傳多態(tài)性分析

2.3.1多態(tài)性分析

30只狨猴在20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)147個(gè)觀察等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)有5～10個(gè)，其中CAJA17、Ham65、Ham61均有10個(gè)等位基因，CAJA1位點(diǎn)有9個(gè)等位基因，表現(xiàn)出較高的多態(tài)性，20個(gè)座位的平均等位基因數(shù)為7.35個(gè)，有效等位基因數(shù)在2.250～6.383個(gè)之間，平均等位基因數(shù)4.040個(gè)。(見(jiàn)表1)

2.3.2雜合度和多態(tài)信息含量

20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的觀察雜合度、期望雜合度、香隆信息指數(shù)以及多態(tài)信息含量分析結(jié)果詳見(jiàn)表2。從表2中可以看出，觀察雜合度最大為0.4667，平均為1.533；期望雜合度在0.1424～0.435之間，平均期望雜合度為0.251；香隆信息指數(shù)在1.2242～2.0324之間，平均為1.5949，PIC在0.5365～0.8253之間，平均PIC為0.7053。

2.4　Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)

用Popgene1.32軟件計(jì)算實(shí)驗(yàn)用狨猴20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)的P值，結(jié)果P值均大于0.05，即30只狨猴在20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg平衡，詳見(jiàn)表2。

表1　狨猴微衛(wèi)星DNA標(biāo)記信息

圖3　Ham26對(duì)4個(gè)樣本的STR掃描結(jié)果Fig.3　Results of Ham26 scanning of 4 samples from the marmosets

序號(hào)No.位點(diǎn)Loci等位基因數(shù)Na有效等位基因數(shù)Ne觀測(cè)雜合度Ho期望雜合度He香隆信息指數(shù)I多態(tài)信息含量PIC遺傳平衡P值Hardy-Weinberg1CAJA194.74930.00000.19721.75010.7614>0.052CAJA663.62900.06670.26331.45030.6826>0.053CAJA1064.25530.06670.22201.57960.7296>0.054CAJA1153.14140.00000.30681.31570.6287>0.055CAJA1364.54550.13330.20681.58800.7447>0.056CAJA1463.26090.20000.29491.38670.6498>0.057CAJA17105.17240.23330.17971.98740.7907>0.058CAJA1882.25000.36670.43501.27850.5366>0.059D10qham5164.76190.13330.19661.65910.7589>0.0510Ham15764.10960.06670.23051.52300.7157>0.0511Ham6084.14750.26670.22821.66840.7286>0.0512Ham65103.32100.20000.28931.67870.6804>0.0513Ham18172.30180.46670.42491.22420.5387>0.0514Ham18474.60360.06670.20401.65380.7513>0.0515Ham12584.56850.13330.20561.72390.7519>0.0516Ham10163.56440.13330.26841.45600.6749>0.0517Ham61106.38300.00000.14242.03240.8254>0.0518Ham3273.68100.20000.25931.60620.7023>0.0519Ham10084.56850.13330.20561.74420.7537>0.0520Ham2683.78950.20000.25141.59190.7001>0.05均值7.354.04020.15330.25061.59490.7053>0.05

3　討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的重要組成，是生命科學(xué)的基礎(chǔ)支撐、活的“精密儀器”，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)化和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的規(guī)范化研究勢(shì)必會(huì)成為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的重要工作。在我國(guó)，狨猴至今仍被定義為“實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物”，即狨猴作為諸多學(xué)科研究用的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，目前尚無(wú)國(guó)家、行業(yè)或地方標(biāo)準(zhǔn)的推出。眾所周知，健康可用于科學(xué)研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，除了要求對(duì)其攜帶的病原微生物、寄生蟲(chóng)進(jìn)行實(shí)施質(zhì)量控制和監(jiān)測(cè)外，還要求實(shí)驗(yàn)動(dòng)物具有清晰和明確的遺傳背景。

狨猴是公認(rèn)的、重要的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，美國(guó)國(guó)家人類基因組研究機(jī)構(gòu)已大力度投資驗(yàn)證了狨猴的基因組序列，這對(duì)狨猴的基因和基因型分析具有重要意義[3]。微衛(wèi)星標(biāo)記存在于大多數(shù)原核及真核生物基因組DNA序列，由2～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成，物種間和物種個(gè)體間的差異及核心序列重復(fù)數(shù)量的不同，便產(chǎn)生微衛(wèi)星DNA標(biāo)記及微衛(wèi)星DNA的多態(tài)性。由于微衛(wèi)星DNA相對(duì)其它分子標(biāo)記分布廣、信息含量高、多態(tài)性豐富、特異性好、操作簡(jiǎn)單、且符合孟德?tīng)柕墓诧@性遺傳定律，近年來(lái)已廣泛用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測(cè)及動(dòng)物群體遺傳結(jié)構(gòu)分析[19-20]。本文通過(guò)查閱文獻(xiàn)[17-18]篩選優(yōu)化了20個(gè)狨猴微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，并對(duì)30只樣本進(jìn)行微衛(wèi)星DNA擴(kuò)增和掃描，初步對(duì)實(shí)驗(yàn)用狨猴群體進(jìn)行了遺傳多樣性分析。等位基因頻率作為評(píng)估遺傳變異的前提和基礎(chǔ)，是指某一等位基因特定基因座位在所有等位基因中所占的比例，在某一個(gè)位點(diǎn)上, 如果它的等位基因頻率最大值< 0.95，通常定義為多態(tài)性位點(diǎn)，本文檢測(cè)的所有等位基因頻率最高為0.65，表明篩選的20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳多樣性較好，有效等位基因數(shù)是反映群體遺傳變異程度的一個(gè)重要指標(biāo)，如果有效等位基因數(shù)與絕對(duì)等位基因數(shù)越接近，表明該等位基因在群體內(nèi)均勻分布度就越好，文中涉及的20個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其中D10ham51的有效等位基因數(shù)和觀察等位基因數(shù)較接近，為1.2381；而Ham65位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)與絕對(duì)等位基因數(shù)相差最大，為6.679，表明該位點(diǎn)的等位基因的均勻分布度較差，有可能是繁育過(guò)程中人工選擇因素所導(dǎo)致。

群體雜合度表示在被檢測(cè)的位點(diǎn)上群體中的雜合子頻率，它是反映群體雜合程度的度量單位，群體平均雜合度的高低反映了群體遺傳的一致性程度，群體雜合度越高，表明該群體的遺傳變異越大，群體遺傳多態(tài)性越高良好的種群平均雜合度在0.5～0.7。本文用Popgene1.32軟件計(jì)算平均觀測(cè)雜合度和平均期望雜合度基本接近，相差范圍僅為-0.05～0.3，表明狨猴群體遺傳變異較小、遺傳一致性較差。而PIC是用以描述微衛(wèi)星基因座多態(tài)性大小的量度單位，Botstein等[21]認(rèn)為當(dāng)基因座位PIC > 0.5為高度多態(tài)位點(diǎn)，低度多態(tài)位點(diǎn)時(shí)，PIC < 0.25。本文的20個(gè)微衛(wèi)星基因座位中，PIC范圍在0.5365～0.8253，平均為0.7053，所有的位點(diǎn)均大于0.500，表明20個(gè)位點(diǎn)均表現(xiàn)為高度多態(tài)性，說(shuō)明所篩選的微衛(wèi)星基因座用于狨猴群體遺傳多樣分析較可靠，表明所監(jiān)測(cè)的狨猴群體具有較豐富遺傳多樣性，選擇潛力較大。此外，香隆指數(shù)是反映種群均勻性分布的一個(gè)重要指標(biāo)，一般情況下其香隆指數(shù)變化在1.5～3之間，本文的20個(gè)微衛(wèi)星基因座位香隆指數(shù)平均值為1.594，表明本地狨猴群體分布及群體交配較隨機(jī)。

Hardy-Weinberg平衡定律是指在一個(gè)群體無(wú)限大、個(gè)體間進(jìn)行隨機(jī)交配、沒(méi)有突變、沒(méi)有遺傳漂變的情況下，群體內(nèi)一個(gè)位點(diǎn)上的基因型頻率和基因頻率將世代保持不變，即處于遺傳平衡狀態(tài)。Hardy-Weinberg檢驗(yàn)P值(HWE)> 0.05時(shí)，表示該位點(diǎn)在群體中處于Hardy-Weinberg平衡；當(dāng)0.01

綜上所述，本文從大量的狨猴微衛(wèi)星DNA座位篩選出分布在不同染色體上20個(gè)標(biāo)記，并隨機(jī)抽取30只人工飼養(yǎng)繁殖的實(shí)驗(yàn)用狨猴樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果均顯示清晰可見(jiàn)的目的條帶及DNA多態(tài)性，表明采用的微衛(wèi)星標(biāo)記能夠較好地反映狨猴種群個(gè)體間的遺傳多樣性。STR掃描結(jié)果經(jīng)軟件分析顯示，除等位基因均勻度分布度較差、群體雜合度的遺傳變異較小、遺傳一致性較差外，其PIC仍處于高度多態(tài)性范圍，即具有較豐富遺傳多樣性，同時(shí)香隆指數(shù)的平均值進(jìn)一步表明本地狨猴群體分布及群體繁殖具有隨機(jī)性。此外，Hardy-Weinberg檢驗(yàn)P值也證實(shí)了狨猴種群得遺傳平衡狀態(tài)。這些結(jié)果均反映了狨猴種群遺傳結(jié)構(gòu)的現(xiàn)狀，為狨猴科學(xué)繁育及遺傳檢測(cè)方法提供了基礎(chǔ)資料。