心房鈉尿肽在基因敲除小鼠黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移中的作用

亓翠玲，曹靜樺，何亞軍，李倩明，李夢(mèng)詩(shī)，楊　揚(yáng)，王麗京

(廣東藥科大學(xué)，基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州　510006)

鈉尿肽(atrial natriuretic peptide, ANP)家族是人們?cè)谛暮湍X中發(fā)現(xiàn)的一種與水鈉代謝有關(guān)的肽類激素家族，包括心房鈉尿肽[1]、腦鈉肽(BNP)[2]、C-型尿鈉肽(CNP)[3]和樹(shù)眼鏡蛇性利尿鈉肽(DNP)[4]。心房鈉尿肽是由心房合成并儲(chǔ)存的的一種活性多肽，具有利鈉利尿、擴(kuò)張血管、降低血壓等作用。心房鈉尿肽與高血壓、心和腎功能不全、妊娠相關(guān)疾病及肺水腫等疾病具有密切的關(guān)系。但是，關(guān)于ANP對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用報(bào)道不多，本文利用ANP敲除小鼠建立黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型，研究ANP對(duì)黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移的作用。

1　材料和方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

ANP敲除純合子小鼠(ANP-/-)，由耿建國(guó)教授惠贈(zèng)，SPF級(jí)，6～8周齡，體重18～20 g，雄性2只，雌性4只。SPF級(jí)雌性C57BL/6J小鼠，6～8周齡，體重18～20 g，10只，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SCXK(粵)2008-0002]。小鼠飼養(yǎng)及操作均在廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[SYXK(粵) 2012- 0125]，并嚴(yán)格遵守廣東藥科大學(xué)動(dòng)物倫理的規(guī)定(福利倫理審查證：gdpulac2015014)。

1.2　細(xì)胞

B16F10黑色素瘤細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1肺轉(zhuǎn)移小鼠模型建立

肺轉(zhuǎn)移小鼠模型根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道建立[5]，簡(jiǎn)單概括為：把處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10細(xì)胞用胰酶消化后，用無(wú)菌PBS調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，用臺(tái)盼藍(lán)染色確定活細(xì)胞數(shù)在95%以上，通過(guò)尾靜脈給每只小鼠注射0.2 mL(1×105個(gè)細(xì)胞)。B16F10細(xì)胞接種后21 d，安樂(lè)死處死小鼠，分離小鼠肺，在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)肺表面轉(zhuǎn)移腫瘤的數(shù)目。

1.3.2病理檢查

腫瘤組織石蠟包埋后，切片。將切片脫蠟至水，自來(lái)水清洗，用蘇木素染色，自來(lái)水沖洗，1%鹽酸乙醇酸化后返藍(lán)，用伊紅染色，脫水用中性樹(shù)膠封片。在顯微鏡下計(jì)數(shù)轉(zhuǎn)移到肺組織中的結(jié)節(jié)數(shù)目。

1.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2　結(jié)果

2.1　ANP敲除抑制了黑色素瘤B16F10細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移

注：與C57BL/6J小鼠比，*P < 0.05。圖1　ANP敲除對(duì)黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移的作用Note. Compared with the C57BL/6J mice，*P < 0.05.Fig.1　Effect of ANP deletion on the number of metastatic foci on the mouse lung surface

2.2　ANP敲除對(duì)肺組織中微轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目的影響

轉(zhuǎn)移模型建立后的第21天，處死小鼠，分離小鼠肺組織，固定、包埋、切片后，HE染色，C57BL/6J小鼠及ANP敲除小鼠的肺組織中都有黑色素瘤轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(見(jiàn)圖2A和2B)，發(fā)現(xiàn)ANP敲除小鼠肺組織中微轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的數(shù)目明顯比C57BL/6J少(見(jiàn)圖2C)。

3　討論

注：(A、B)C57BL/6J小鼠及ANP敲除小鼠肺組織的HE染色圖(Bar=500 μm)及局部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的放大圖(Bar=50 μm)；與C57BL/6J小鼠比較，***P< 0.001。圖2　ANP敲除顯著抑制了肺組織中微轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)目Note. Compared with the C57BL/6J mice，***P < 0.001.Fig.2　Effect of ANP deletion on the number of micrometastatic foci in the mouse lung tissues revealed by histopathology. HE staining

心房鈉尿肽作為一種經(jīng)典的血管活性肽，在腫瘤中的作用研究甚少。本研究利用ANP敲除小鼠和C57BL/6J小鼠，通過(guò)尾靜脈注射黑色素瘤B16F10細(xì)胞，建立黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移瘤小鼠模型。利用ANP敲除小鼠研究黑色素瘤對(duì)肺轉(zhuǎn)移的作用，較其它模型具有一大優(yōu)點(diǎn)：ANP基因的作用在小鼠中被完全消除，更能明確證實(shí)ANP基因在黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移中的作用。本研究利用ANP敲除小鼠建立肺轉(zhuǎn)移模型，此模型具有腫瘤發(fā)生率高、容易建立、時(shí)間短、腫瘤轉(zhuǎn)移均一性好、個(gè)體差異小等優(yōu)點(diǎn)。利用此小鼠模型，我們發(fā)現(xiàn)ANP敲除顯著抑制了黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移。但文獻(xiàn)報(bào)道用ANP治療DMBA (initiator)/croton oil誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌，發(fā)現(xiàn)ANP通過(guò)激活NF-κB信號(hào)、肥大細(xì)胞及MMP2/9顯著抑制了皮膚癌的生長(zhǎng)[6]。Takashi等[7]也報(bào)道ANP通過(guò)抑制肺癌A549細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞粘附，進(jìn)而抑制了腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。這些研究與我們的研究結(jié)果相反，需要進(jìn)一步探討。與我們研究不一致的原因可能如下：我們是利用ANP敲除小鼠研究ANP對(duì)黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移的作用，主要觀察ANP基因?qū)δ[瘤的作用，而Takashi等主要是用ANP蛋白治療腫瘤小鼠模型，研究ANP蛋白對(duì)腫瘤的作用，ANP在基因水平及蛋白水平對(duì)腫瘤的作用可能不一致。

綜上所述，ANP與黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系，在黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著正向調(diào)控的重要作用，但ANP對(duì)B16F10黑色素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制還不明確，需要進(jìn)一步的探討。若進(jìn)一步探討ANP對(duì)腫瘤的作用，可為判斷患者預(yù)后及尋找理想的抗腫瘤治療靶點(diǎn)提供重要的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：