低氧環(huán)境對高原鼠兔骨骼肌HIF-1α和VEGF表達的影響

謝惠春 羅巧玉 陳 志 喬 楓

(青藏高原藥用動植物資源青海省重點實驗室，青海師范大學，西寧，810008)

在缺氧以及組織缺血的生理條件下，低氧誘導因子－1(Hypoxia-inducible factor，HIF-1)對機體恢復穩(wěn)態(tài)有著重要的意義。HIF-1α在細胞代謝調(diào)控中傾向于調(diào)控糖酵解途徑中相關酶的基因轉錄與表達，如乳酸脫氫酶，己糖激酶等［1－2］，而 HIF-2α卻在細胞脂肪酸代謝途徑中發(fā)揮重要的作用［3］，HIF-1α亞基的積累對保護組織對抗低氧的幾個靶向基因起調(diào)控的作用［4］。同時，在氧氣供應不足及血流供應不足的情況下，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)被認為是一種由細胞產(chǎn)生的信號蛋白，在恢復組織供氧，以及改善血管功能和血管生成中起到重要的作用［5］。

高原鼠兔(Ochotona curzoniae)，一種生活在青藏高原高寒草甸海拔約3000 m的小型植食性哺乳動物。能夠完全適應高寒缺氧的環(huán)境［6］。由于高原鼠兔具有低氧耐受性，使其成為一種用于研究急性或慢性缺氧下機體生理和生態(tài)適應性的獨特模式動物［7－8］，同時被廣泛地用于研究機體適應低氧環(huán)境潛在的細胞和分子機制［9］。

骨骼肌纖維按其代謝過程的不同可分為氧化型和糖酵解型，例如，氧化型肌纖維主要使用氧化磷酸化生成ATP［10］。另外，氧化型肌纖維中含有大量的肌紅蛋白，作為氧結合蛋白可以存儲氧氣并加速其遞送至肌肉細胞內(nèi)的線粒體中。與此相反，糖酵解型肌纖維具有較低水平的肌紅蛋白，其獲得能量的主要方式依賴于糖酵解［11］。然而，低氧環(huán)境中，兩種肌纖維中HIF-1α和VEGF的表達還鮮有研究。

因此，我們的研究內(nèi)容是在低氧暴露下，比較高原鼠兔和SD大鼠(Rattus norregicus)2種肌纖維中HIF-1α和VEGF的表達量及其對低氧應激的響應機制。此外，我們在后肢肌肉中注射HIF-1α的抑制劑2－甲氧基雌二醇(2-MeOE2)，然后檢測骨骼肌中VEGF的水平，從而確定骨骼肌中HIF-1α對VEGF的影響。我們假設高原鼠兔與SD大鼠在低氧暴露條件下骨骼肌中HIF-1α和VEGF的表達量減少。同時我們推測在骨骼肌中HIF-1α可以調(diào)節(jié)VEGF的表達量。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

2014年5月，在青海省海北自治州祁連縣野牛溝鄉(xiāng)達玉村(E99°16'，N38°42'，海拔 3960 m)捕獲 51只健康成年雄性高原鼠兔(150～200 g)，帶回西寧(海拔2300 m)置于動物飼養(yǎng)箱內(nèi)，飼以矮生嵩草(Carex alatauensis)、高山嵩草(Carex parvula)、早熟禾(Poa spp．)、二裂委陵菜(Potentilla bifurca)等生境青草和胡蘿卜(Daucus carota)，適應3周后用于實驗，78只SD大鼠購于青海省地方病研究所。

1.2 儀器及試劑

Innovative Instruments氧傳感器(美國)，70 cm×70 cm×50 cm通風艙體(自制)，BIO-RAD X-mark酶標儀(美國)，MB100-4P微孔板孵育器(美國)，2-甲氧基雌二醇(Selleck Chem．Co．)，HIF-1α ELISA 試劑盒(Abcam Co．)，VEGF ELISA 試劑盒(R＆D System)，2%BSA溶液(50 mmol/L碳酸鹽緩沖液pH 9.5配制)。

1.3 實驗方法

1.3.1 低氧模擬

由氧傳感器控制，艙體通風通入21%(O2/N2%)作為海平面對照混合氣體，10.8%(海拔5000 m)氧氣通風作為低氧脅迫環(huán)境模擬［11］。對照組以鋸末作籠墊，棉花作巢材，室溫(21±1)℃，光周期14L∶10D條件下正常飼養(yǎng)，后肢肌肉腓腸肌注射2-MeOE2模擬低氧暴露。

1.3.2 骨骼肌中HIF-1α和VEGF表達水平的檢測

實驗動物高原鼠兔(n=45)、SD大鼠(n=60)10.8%氧氣通風低氧脅迫6 h后斷頭處死，對照組高原鼠兔(n=6)、SD大鼠(n=6)室內(nèi)通風飼養(yǎng)，同一時段斷頭處死，取后肢腓腸肌。需要注意的是，腓腸肌深紅色部分為氧化型肌纖維，淺白色部分主要是由糖酵解肌纖維構成。雙位點免疫酶測定法(ELISA)檢測骨骼肌中HIF-1α和VEGF的表達水平。用親和純化的多克隆兔抗HIF-1α抗體/小鼠抗VEGF抗體微量滴定聚苯乙烯96孔板。平行孔用純化的兔/小鼠IgG非特異性信號評估。室溫下溫浴過夜，50 mmol/L Tris－HCl清洗板體后，2%BSA(pH 9.5)溶液孵育2 h。徹底清洗后，將稀釋的樣品和HIF-1α/VEGF的標準溶液分布在各板孔，室溫過夜。洗滌后每孔加入半乳糖苷酶用以抗HIF－1α和VEGF。底物溶液37℃孵育2 h后酶標儀測定讀數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析處理

所有數(shù)據(jù)使用雙向重復測量，方差分析，用SE表示。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05被認為是有統(tǒng)計學意義。

2 結果

結果顯示，高原鼠兔(n=6)與SD大鼠(n=6)氧化和糖酵解型肌纖維中HIF-1α和VEGF的基礎表達水平無顯著性差異。在SD大鼠的氧化和糖酵解型肌纖維中HIF-1α表達量分別為(1.76±0.20)ng/mL和(2.51±0.22)ng/mL，而在高原鼠兔的氧化和糖酵解型肌纖維中HIF-1α表達量分別為(1.68±0.16)ng/mL(P＞0.05)和(1.97±0.31)ng/mL(P＞0.05)。此外，SD大鼠在氧化和糖酵解型肌纖維中VEGF表達量分別為(25.65±2.33)pg/mL和(27.62±3.12)pg/mL，而高原鼠兔分別為(23.45±2.81)pg/mL(P＞0.05)和(24.89±3.20)pg/mL(P＞0.05)。

圖1 高原鼠兔和SD大鼠不同條件下氧化和糖酵解型肌纖維中HIF-1α和VEGF表達Fig.1 The expreesion of HIF-1α and VEGF in oxidative and glycolytic muscles of SD rats and pikas in different conditions

如圖1所示，低氧脅迫下，無論是高原鼠兔(n=15)還是SD大鼠(n=20)氧化和糖酵解型肌纖維中HIF-1α和VEGF表達水平都顯著高于常氧對照組。與常氧組比較，高原鼠兔HIF-1α和 VEGF表達的增幅量要顯著低于SD大鼠的增幅量(P＜0.05)。此外，在后肢腓腸肌注射HIF-1α抑制劑2-MeOE2后，低氧暴露條件下，SD大鼠和高原鼠兔骨骼肌中VEGF的表達量與不注射2-MeOE2組相比顯著降低(P＜0.05)。需要注意的是，我們還測定了在注射2-MeOE2后HIF-1α的表達水平，以證實其在這個實驗中的有效性。SD大鼠(n=12)氧化型肌纖維中HIF-1α的表達量在響應低氧條件下為(3.26±0.36)ng/mL(P＜0.05)，在糖酵解型肌纖維中為(4.52±0.56)ng/mL(P＜0.05)，而注射2-MeOE2后SD大鼠(n=12)氧化型肌纖維中HIF-1α的表達量為(1.85±0.22)ng/mL，在糖酵解型肌纖維中為(2.62±0.32)ng/ml。

在低氧脅迫條件下，SD大鼠(n=20)和高原鼠兔(n=15)骨骼肌氧化型肌纖維中HIF-1α和VEGF的增高(r=0.76，P＜0.01)和糖酵解型肌纖維中HIF-1α和VEGF的增高(r=0.72，P＜0.01)存在線性關系(圖2)。

圖2 低氧應激下高原鼠兔和SD大鼠氧化和糖酵解型肌纖維中HIF-1α和VEGF的線性關系Fig.2 The linear relationship between the levels of HIF-1α and VEGF in oxidative and glycolytic muscles of SD rats and pikas in response to hypoxic stress

3 討論

HIF-1α被認為是細胞進行代謝途徑中一個關鍵的氧傳感器［1－2］。在這項研究中，我們檢測了后肢腓腸肌氧化和糖酵解型肌纖維中HIF-1α蛋白表達。如以往報道［12］，盡管在常氧條件下，高原鼠兔和SD大鼠氧化和糖酵解型肌纖維中HIF-1α的表達組間沒有顯著性差異，但是我們發(fā)現(xiàn)HIF-1α在糖酵解型肌纖維中的表達要顯著高于氧化型肌纖維。此外，在低氧暴露條件下，HIF-1α的應激反應也表現(xiàn)為糖酵解型肌纖維高于氧化型肌纖維。重要的是，我們的研究表明，無論是高原鼠兔還是SD大鼠，氧化型肌纖維和糖酵解型肌纖維在響應低氧應激時均表現(xiàn)出HIF-1α的蛋白表達水平的升高。

根據(jù)能量代謝的途徑不同，可將骨骼肌纖維可分為氧化型和糖酵解型［10］。在常氧條件下，骨骼肌纖維的類型由肌紅蛋白含量決定，同時與HIF-1α的表達量具有相關性。氧化型肌纖維中含有較多的肌紅蛋白，但HIF-1α含量較低［13］。同樣的，糖酵解肌纖維中肌紅蛋白水平低，但卻含有高的HIF-1α。以往研究表明［14］，一個給氧調(diào)節(jié)系統(tǒng)主要是以肌紅蛋白為基礎的氧化肌纖維和以HIF-1α復合體為基礎的糖酵解肌纖維。然而，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，在高原鼠兔無論是在氧化型肌纖維還是在糖酵解型肌纖維中HIF-1α的表達量相比SD大鼠都表現(xiàn)出弱的反應性，這可能提示，在長期低氧脅迫環(huán)境下，肌紅蛋白與HIF-1α之間存在的平衡關系可能被改變。

此外，我們的結果表明，在低氧脅迫條件下，高原鼠兔和SD大鼠氧化型和糖酵解型肌纖維中血管內(nèi)皮生長因子VEGF的表達水平都有提升。HIF-1α反應和VEGF反應之間存在密切的相關性。低氧誘導產(chǎn)生的VEGF水平的升高，在當HIF-1α被抑制劑抑制以后，后肢肌肉中VEGF水平降低。這表明，在低氧脅迫條件下，HIF-1α對調(diào)節(jié)骨骼肌VEGF的表達有重要的意義，其中一個重要的調(diào)節(jié)作用就是調(diào)節(jié)血管功能和提高血流量。

應當注意的是，低氧脅迫下，我們運用線性分析后得出骨骼肌中HIF-1α和VEGF表達水平具有密切的相關性。后期研究將針對VEGF抑制劑對HIF-1α表達水平的影響，從而最終確定兩者之間的聯(lián)系。

總之，該研究結果表明，(1)在低氧脅迫條件下，對比SD大鼠，高原鼠兔骨骼肌中HIF-1α和VEGF的功能反應表現(xiàn)出不敏感型;(2)在低氧環(huán)境中，HIF-1α對骨骼肌中VEGF起調(diào)節(jié)作用。我們對高原鼠兔在低氧脅迫條件下的生理生態(tài)適應及其低氧適應機制進行研究，意在揭示人體低氧組織適應/預適應的實質及機體抗/耐缺氧的生物學策略，同時為高原醫(yī)學提供基礎理論數(shù)據(jù)。

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