蘆薈多糖對炎癥性腸病小鼠免疫功能及OX40、OX40L表達的影響*

劉 達 諸凡凡 向正國△

（1.解放軍第101醫(yī)院，江蘇 無錫 214000；2.江蘇省無錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無錫 214000）

炎癥性腸?。↖BD）是發(fā)生于結(jié)腸、直腸和回腸的一種特發(fā)于腸道的炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病［1］。IBD一般多伴隨反復持續(xù)性腹瀉、腹痛、血便等臨床癥狀。隨著人們生活方式的改變和生活水平的提高，IBD的發(fā)生率呈逐漸增加趨勢［2］，然而其發(fā)病機制尚不清楚。中醫(yī)學認為，本病是由勞心過度、寒涼不謹引起，基本病機是脾虛失運、氣滯血瘀、濕熱邪毒等，屬于“腸澼”“痢疾”等范疇［3］。 蘆薈多糖是提取自蘆薈的有效成分之一，具有抗感染、瀉下、抗腫瘤等藥理活性［4］。據(jù)報道，蘆薈多糖可有效促進損傷組織的再生和修復，改善造血功能，對應激性潰瘍等疾病具有良好的治療作用［5］，但其作用機制尚不清楚。本研究通過構(gòu)建IBD小鼠模型，觀察蘆薈多糖對IBD模型小鼠結(jié)腸黏膜組織中免疫功能，以及對結(jié)腸黏膜組織中OX40、OX40L表達的影響，以期揭示蘆薈多糖改善炎癥性腸病的分子機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只雄性健康SPF級BALB/c小鼠，體質(zhì)量（22±2）g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）-2013-0002。于本院實驗動物中心常規(guī)飼養(yǎng)，自由飲水，飲食。所有實驗均經(jīng)本院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 試劑與儀器 蘆薈多糖，純度98%，規(guī)格1 g，上海源葉科技生物公司，批號20161108；柳氮磺吡啶（SASP）腸溶片（信宜），規(guī)格 0.25 g，購自上海福達制藥有限公司， 批號 20160605；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS，貨號 P2297），規(guī)格 10 mL，購自美國 Sigma 公司；戊巴比妥鈉（貨號096956-001），購自北京華業(yè)寰宇化工公司；HE染色試劑盒（貨號E607318-0200）、蛋白提取試劑盒（貨號C006225-0050）、BCA試劑盒（貨號 C503021-0500）、DAB 顯色試劑盒（貨號 E670033），購自上海生工生物技術(shù)公司；Anti-OX40（貨號ab213894）、Anti-CD134/OX40L（貨號 ab80677）、Anti-GAPDH （貨號ab181602），均購自美國Abcam公司。Olympus CX41光學顯微鏡，日本Olympus公司；石蠟烤片機、切片機，購自德國Leica公司；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀，購自美國Bio-Rad公司；Tanon 5500發(fā)光成像系統(tǒng)，購自上海天能公司等。

1.3 造模與分組 采用TNBS法構(gòu)建IBD小鼠模型［6］。造模開始前小鼠禁食不禁水24 h，術(shù)前給予小鼠1.5%戊巴比妥鈉（0.5 mL/100 g）腹腔注射麻醉，采用100 mg/kg TNBS造模，將無菌輸液管插入小鼠肛門上段約8 cm處，采用1 mL注射器抽吸TNBS原液（0.2 mL/100 g）后，抽吸 0.25 mL 50%乙醇，混合均勻后，經(jīng)無菌輸液管輕輕推入混合試劑，維持小鼠肛門高位狀態(tài)2 min，將小鼠轉(zhuǎn)移至飼養(yǎng)籠中。術(shù)中、術(shù)后維持小鼠體溫均在（37±0.5）℃。正常對照組正常飼喂，不做任何處理。每日記錄小鼠攝食量、飲水量、大便性狀、活動情況等。本研究造模未造成小鼠死亡，共計50只小鼠造模成功。隨機分為模型組、SASP組及蘆薈多糖低、中、高劑量組，每組10只，另設(shè)正常對照組10只。

1.4 給藥方法 蘆薈多糖低、中、高劑量組每天按時予蘆薈多糖 150、300、600 mg/（kg·d） 灌胃治療；SASP組予 SASP 514 mg/（kg·d）灌胃治療，相當于人臨床用藥劑量的12倍；正常對照組及模型組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，各組均連續(xù)灌胃給藥10 d。

1.5 標本采集與檢測 末次給藥結(jié)束后，麻醉處死小鼠，迅速取出其結(jié)腸黏膜組織，分為2份，一份置于4%多聚甲醛中固定，制備石蠟切片；一份置于液氮中速凍，-80℃保存。1）小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）評分變化。按照Okayasu等評分標準［7］，對各組小鼠大便性狀、體質(zhì)量變化、大便隱血情況進行觀察并評分，計算各小鼠疾病活動指數(shù)積分。2）小鼠結(jié)腸黏膜組織病理變化。對小鼠結(jié)腸黏膜組織石蠟切片進行脫蠟、水化處理。按照HE法染色流程對切片進行染色，中性膠封片，置于光學顯微鏡下，觀察小鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)并拍照。3）小鼠胸腺、脾臟系數(shù)測定及碳粒廓清試驗。藥物作用第10日，稱取小鼠體質(zhì)量。將印度墨汁注射進各小鼠尾靜脈后立即計時，分別于第30、300 s從小鼠內(nèi)眥靜脈處采血15 μL，加入2 mL 0.1%Na2CO3，混勻。同樣方法取正常對照組小鼠靜脈血校零，于675 nm處測定血清光密度（OD）值，分別記為OD1、OD2。計算吞噬指數(shù) K，K=（lgOD1-lgOD2）/270。第 2次內(nèi)眥靜脈處采血1后，麻醉處死小鼠，立即取其胸腺和脾臟，除去表面污血，精密稱量小鼠胸腺、脾臟、肝臟質(zhì)量，計算各臟器系數(shù)和校正吞噬指數(shù)α。胸腺系數(shù)（mg/g）=胸腺質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），脾臟系數(shù)（mg/g）=脾臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g），α=體質(zhì)量/（肝臟質(zhì)量+脾臟質(zhì)量）×K1/3。4）小鼠血清溶血素水平測定。藥物作用第4日，將0.2 mL綿羊紅細胞注射進小鼠腹腔。第10日給藥1后，從小鼠內(nèi)眥靜脈處采血200 μL。2000 r/min離心10 min，取5 μL血清加入1 mL 0.9%氯化鈉注射液中 （稀釋200倍），混勻后加入0.5 mL 10%綿陽紅細胞（SRBC）懸液，再加入1 mL 10%豚鼠血清，室溫靜置10 min后冰浴10 min，2000 r/min離心10 min，以0.9%氯化鈉注射液校零，于540 nm處測定上層液OD值，另取0.25 mL 100 g/L SRBC，加入3.75 mL都氏試劑，同樣方法測定OD值，作為SRBC半數(shù)溶血值。計算小鼠血清半數(shù)溶血值 （HC50），可表示血清溶血素含量，HC50=小鼠血清吸光度/SRBC半數(shù)溶血值×稀釋倍數(shù)。5）蛋白印記（WB）法檢測OX40、OX40L蛋白表達水平。將小鼠結(jié)腸黏膜冷凍組織在液氮中研磨，加入1.2 mL蛋白裂解液（含protease inhibitor），提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白總量。SDS-凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上；5%脫脂奶粉，封閉1 h；分別加入一抗Anti-OX40、Anti-OX40L、Anti-GAPDH（1∶500），4 ℃孵育過夜；加入二抗（1∶5000），室溫孵育 1 h。 經(jīng)化學發(fā)光法進行檢測，Tanon軟件拍攝圖像并進行半定量分析。1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠疾病活動指數(shù)積分比較 見表1。正常組小鼠飲食、活動度、體質(zhì)量及大便情況均正常，小鼠疾病活動指數(shù)積分為0。模型組小鼠表現(xiàn)出厭食、厭動、體質(zhì)量減輕及稀水樣便等結(jié)腸炎病癥，小鼠疾病活動指數(shù)積分顯著升高。藥物處理10 d后，與模型對照組比較，SASP組及蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸炎病癥顯著減輕，小鼠疾病活動指數(shù)積分顯著降低，蘆薈多糖高劑量組降低程度大于蘆薈多糖中劑量組 （均P＜0.05）。

表1 各組小鼠疾病活動指數(shù)積分比較（分，±s）

表1 各組小鼠疾病活動指數(shù)積分比較（分，±s）

與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與蘆薈多糖低劑量組比較，▲P＜0.05；與蘆薈多糖中劑量組比較，＃P＜0.05。下同。

?

2.2 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)比較 見圖1。正常對照組小鼠結(jié)腸黏膜組織結(jié)構(gòu)完整、層次清晰、細胞排列規(guī)則有序、無炎性細胞浸潤；與正常對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸黏膜組織細胞排列稀疏紊亂、上皮細胞大量缺失，可見大量炎性細胞浸潤；藥物作用10 d后，蘆薈多糖高、中、低劑量組小鼠結(jié)腸黏膜細胞組織結(jié)構(gòu)逐漸恢復完整，細胞排列基本規(guī)則，可見少量炎性細胞。

圖1 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（HE染色，400倍）

2.3 各種小鼠免疫功能指標比較 見表2。與正常對照組比較，模型組小鼠胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)、吞噬指數(shù) K、校正吞噬指數(shù)α、半數(shù)溶血值均明顯增高（P＜0.05）；藥物作用10 d后，與模型組比較，蘆薈多糖低、中、高劑量組小鼠胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)、吞噬指數(shù)K、校正吞噬指數(shù)α、半數(shù)溶血值均顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴效應。

表2 各組小鼠免疫功能指標比較（±s）

表2 各組小鼠免疫功能指標比較（±s）

?

2.4 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織中OX40、OX40L蛋白表達比較 見圖2、表3。與正常對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸黏膜組織中OX40、OX40L蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；藥物作用10 d后，與模型組比較，低、中、蘆薈多糖高劑量組小鼠結(jié)腸黏膜組織中OX40、OX40L蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），呈劑量依賴效應。

圖2 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織中OX40、OX40L蛋白表達水平

表3 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織中OX40、OX40L蛋白表達比較（±s）

表3 各組小鼠結(jié)腸黏膜組織中OX40、OX40L蛋白表達比較（±s）

?

3 討 論

IBD發(fā)生時，機體腸道免疫作用處于過度激活狀態(tài)，黏膜組織分泌的促炎癥細胞因子增多，抗炎癥細胞因子相對較少，從而引起腸道免疫功能發(fā)生紊亂，導致炎癥因子在結(jié)腸等處累積，引起潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生［8］。蘆薈多糖因其抗感染、促進損傷修復、提高免疫等藥理活性，已被證明對實驗性口腔潰瘍、實驗性結(jié)腸炎等炎癥性疾病具有治療作用［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)，造模期間，模型組小鼠表現(xiàn)出厭食、厭動、體質(zhì)量減輕及稀水樣便等潰瘍性結(jié)腸炎病癥，疾病活動指數(shù)積分顯著升高。蘆薈多糖干預10 d后，與模型對照組比較，蘆薈多糖組小鼠腸炎癥狀明顯減輕，疾病活動指數(shù)積分顯著降低，表明蘆薈多糖具有治療潰瘍性結(jié)腸炎的功效。結(jié)腸黏膜HE染色結(jié)果顯示，蘆薈多糖可不同程度地減輕潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜組織病理損傷，不同程度地改善炎性細胞浸潤情況，細胞排列逐漸規(guī)則，結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)趨于完整，表明蘆薈多糖對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜組織損傷具有一定保護作用，對結(jié)腸黏膜病變具有改善作用。

潰瘍性結(jié)腸炎是指結(jié)腸或直腸粘膜及黏膜下層發(fā)生炎癥性病變，導致患者出現(xiàn)體質(zhì)量減輕、嘔吐、腹痛、便血等癥狀，目前認為是由于免疫、遺傳、感染及心理等多種因素相互作用的結(jié)果［11］。研究發(fā)現(xiàn)，腸道免疫調(diào)節(jié)異常在炎癥性腸病尤其是潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生過程中具有重要作用，當機體受到細菌、病毒等感染后，腸道免疫作用過度激活［12］。胸腺是哺乳動物重要的中心免疫器官，免疫活性細胞在胸腺組織中產(chǎn)生、增殖、分化，發(fā)揮調(diào)節(jié)全身免疫反應等重要作用［13］；脾臟則是重要的外周免疫器官，免疫細胞再此聚集，產(chǎn)生特異性抗體等活性物質(zhì)，通過一系列免疫應答，清除外源病原物［14］。研究表明，動物臟器系數(shù)在一定程度上可反映該器官的生物學功能的強弱，血清中抗體含量則是衡量特異性免疫應答水平的直接指標［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)、半數(shù)溶血值明顯高于正常對照組小鼠，蘆薈多糖作用后，低、中、蘆薈多糖高劑量組小鼠胸腺系數(shù)、脾臟系數(shù)、半數(shù)溶血值均顯著降低，呈一定劑量依賴效應。胸腺和脾臟系數(shù)的降低表明小鼠胸腺和脾臟免疫功能的降低，半數(shù)溶血值的降低表明小鼠血清中抗體含量的下降，提示蘆薈多糖具有減弱小鼠免疫功能、抑制腸道免疫過度激活的作用。巨噬細胞是負責吞噬和清除外源病原物的重要免疫活性細胞，其吞噬能力的強弱可反映非特異性免疫功能的強弱，一般采用巨噬細胞吞噬百分率來評價其吞噬能力［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組小鼠吞噬指數(shù)K、校正吞噬指數(shù)α均明顯升高，與模型組比較，低、中、高劑量蘆薈多糖作用后小鼠吞噬指數(shù)K、校正吞噬指數(shù)α均顯著減小，呈劑量依賴效應，提示蘆薈多糖可抑制巨噬細胞的過度吞噬作用，抑制小鼠的非特異性免疫反應的過度激活。

有報道稱，IBD是一種自身免疫性疾病，其發(fā)生與腸道免疫反應紊亂有關(guān)，由Th1/Th2平衡被打破所致［17］。研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生時，機體免疫細胞處于過度活化狀態(tài)，產(chǎn)生并釋放多種炎性因子，一系列的腸道免疫功能過度激活是造成IBD發(fā)生的原因之一［18］。OX40/OX40L是T細胞-抗原呈遞細胞應答過程中的一對重要的協(xié)同刺激分子，T細胞表面的OX40與抗原呈遞細胞表面的OX40L結(jié)合時，可將一個協(xié)同刺激信號傳遞給T細胞，進而促進細胞克隆，增強其效應功能，OX40主要作用于T細胞效應的晚期階段，可促進機體產(chǎn)生更多的記憶T細胞［19］。在疾病發(fā)生過程中，OX40只在炎癥浸潤部位的活化CD4+T細胞表面，OX40L則表達于炎癥浸潤部位的吞噬細胞、B細胞、樹突狀細胞等抗原呈遞細胞表面［20］，因此OX40/OX40L表達水平可作為自身免疫應答反應的強弱，為臨床診斷和疾病治療提供一定參考。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)腸黏膜組織中OX40、OX40L蛋白表達水平均顯著高于對照組，不同劑量蘆薈多糖作用后，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸黏膜組織中OX40、OX40L蛋白表達水平顯著低于模型組，且呈一定劑量依賴效應，表明蘆薈多糖作用后OX40/OX40L表達水平下調(diào)，提示蘆薈多糖可能抑制T細胞-抗原呈遞細胞應答過程，抑制小鼠自身免疫反應的過度激活。

綜上所述，蘆薈多糖可能通過下調(diào)OX40、OX40L表達抑制T細胞-抗原呈遞細胞應答過程及免疫功能的過度激活，從而發(fā)揮對潰瘍性結(jié)腸炎所致結(jié)腸黏膜損傷的保護作用。

［1］Podolsky DK.Inflammatory bowel disease［J］.N Engl J Med，2002，347（6）：417-429.

［2］Burisch J，Munkholm P.Inflammatory bowel disease epidemiology［J］.Curr Opin Gastroenterol，2013，29（4）：357-362.

［3］劉玉暉，胡婕，易文鳳，等.參苓白術(shù)散治療炎癥性腸病與腸上皮細胞緊密連接的關(guān)系探討［J］.中國實驗方劑學雜志，2015，21（3）：130-133.

［4］張雙，高鷹，李黎仙，等.蘆薈提取物對脂多糖誘導的人牙周膜細胞炎性反應的抑制作用［J］.實用口腔醫(yī)學雜志，2017，33（4）：522-525.

［5］Tabandeh MR，Oryan A，Oryan A，et al.Polysaccharides of Aloe vera induce MMP-3 and TIMP-2 gene expression during the skin wound repair of rat［J］.Int J Biol Macromol，2014，65（5）：424-430.

［6］Dubuquoy L，Jansson EA，Deeb S，et al.Impaired expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma in ulcerative colitis［J］.Gastroenterology，2003，124（5）：1265-1276.

［7］Okayasu I，Hatakeyama S，Yamada M，et al.A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice［J］.Gastroenterology，1990，98（3）：694-702.

［8］Matsuoka K，Kanai T.The gut microbiota and inflammatory bowel disease［J］.Semin Immunopathol，2015，37（1）：47-55.

［9］王哲哲，張雪，高永峰.蘆薈多糖對實驗性口腔潰瘍大鼠NF-κB和MMP2表達的影響［J］.中國藥理學與毒理學雜志，2017，31（5）：483-484.

［10］張文志，歐水平，吳會超，等.蘆薈多糖對實驗性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜的保護作用及其機制研究［J］.實用醫(yī)學雜志，2016，32（3）：352-355.

［11］Stecher B.The roles of inflammation，Nutrient availability and the commensal microbiota in enteric pathogen infection ［J］.Microbiol Spectr，2015，3（3）：1128-1134.

［12］Cantorna MT，Mcdaniel K，Bora S，et al.Vitamin D，immune regulation，the microbiota， and inflammatory bowel disease［J］.Exp Biol Med，2014，239（11）：278-284.

［13］Luis TC，Luc S，Mizukami T，et al.Initial seeding of embryonic thymus by immune-restricted lympho-myeloid progenitors［J］.Nat Immunol，2016，17（12）：1424-1435.

［14］Jung WC，Levesque JP，Ruitenberg MJ.It takes nerve to fight back：The significance of neural innervation of the bone marrow and spleen for immune function［J］.Semin Cell Dev Biol，2016，20（6）：60-70.

［15］葉穎霞，林嵐，趙菊香，等.杜仲葉多糖對免疫抑制小鼠免疫功能的影響［J］.中藥材，2015，38（7）：1496-1498.

［16］Pennathur S，Pasichnyk K，Bahrami NM，et al.The macrophage phagocytic receptor CD36 promotes fibrogenic pathways on removal of apoptotic cells during chronic kidney injury［J］.Am J Pathol，2015，185（8）：2232-2245.

［17］Yang X，He Q，Guo Z，et al.MicroRNA-425 facilitates pathogenic Th17 cell differentiation by targeting forkhead box O1（Foxo1） and is associated with inflammatory bowel disease［J］.BiochemBiophysResCommun，2018，496（2）：352-358.

［18］Hisamatsu T，Kanai T，Mikami Y，et al.Immune aspects of the pathogenesis of inflammatory bowel disease［J］.Pharmacol Ther，2013，137（3）：283-297.

［19］Papadopoulos C，Terzis G，Papadimas GK，et al.OX40-OX40L expression in idiopathic inflammatory myopathies［J］.Anal Quant Cytopathol Histpathol，2013，35（1）：17-26.

［20］Kinnear G，Wood KJ，F(xiàn)allah-Arani F，et al.A diametric role for OX40 in the response of effector/memory CD4+T cells and regulatory T cells to alloantigen［J］.J Immunol，2013，191（3）：1465-1475.