消栓飲對創(chuàng)傷性深靜脈血栓兔核因子NF-κB的影響*

簡功輝 陳俊龍 黃永松 李冬春 王 勇△

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，湖南 長沙410005）

深靜脈血栓（DVT）是由于血液在管腔內(nèi)的異常凝集出現(xiàn)的以肢體腫脹、甚則局部青紫、疼痛難忍為代表的深靜脈功能不全疾病。研究表明，炎癥與DVT聯(lián)系緊密［1］，其誘導并加重血栓形成近年來已經(jīng)達成國內(nèi)外共識；同時，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB作為多基因表達的調(diào)控點，廣泛參與機體炎癥反應［2］，是近年來研究的熱點，其作為炎癥反應的中心環(huán)節(jié)可能與深靜脈血栓的形成存在某種橋梁關系。消栓飲是本文通信作者湖南省中醫(yī)院王勇教授通過多年經(jīng)驗總結(jié)而成。本研究擬通過消栓飲作用于創(chuàng)傷性深靜脈血栓兔靜脈壁NF-κB p65 mRNA、IKBa mRNA 及血清 NF-κB 的變化，判斷以NF-κB信號為中心的炎癥過程中深靜脈血栓的轉(zhuǎn)歸，進一步明確消栓飲防治DVT的作用機理?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康的新西蘭大白兔45只，體質(zhì)量 2.0～3.0 kg，雄性，實驗動物許可證：SYXK（湘）2013-0005。質(zhì)量合格證：43608300000256，由湖南太平生物科技有限公司提供。

1.2 試藥與儀器 消栓飲：黃芪50 g，丹參30 g，大腹皮 15 g，白芍 30 g，歸尾 10 g，川牛膝 15 g，茯苓 10 g，澤瀉 10 g，枳殼 10 g，桂枝 6 g，豬苓 10 g，陳皮 10 g，甘草6 g。由湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中藥房統(tǒng)一制成120 mL濃縮藥液 （生藥質(zhì)量濃度為1.77 g/mL），封包備用；低分子肝素鈉注射液 （活多史，國藥準字H20053199，昆明積大制藥股份公司，4250 IUaXA 0.4 mL，批號：161008）；戊巴比妥鈉（上海哈靈生物科技有限公司，規(guī)格 5 g/瓶）。Trizol試劑（ambion，15596026）、SYBR Green PCR 試劑盒 （KAPA Biosystems，KM4101）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 （TAKARA，639505）、RNase I（Fermentas，AM2295）、DEPC 處理水（bioswamp，PAB180005）。 熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD）、水平電泳設備（美國BIO-RAD）、凝膠成像系統(tǒng)（美國 BIO-RAD）、PCR 儀（美國 BIO-RAD）、顯微鏡（OLYMPUS 公司）、彩色病理圖像分析儀（OLYMPUS公司）、醫(yī)用離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 造模與分組 參照張春強［3］的造模方法，采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）沿耳緣靜脈注射麻醉后左腹股溝內(nèi)側(cè)沿大腿股靜脈方向縱形切開3 cm的傷口，逐層分離顯露股靜脈血管及其屬支，再使用12.5 mm全齒蚊氏鉗選擇股靜脈上相隔5 mm距離的3處不同位置鉗夾（一格力量）各3 s，鉗夾后，用3-0號絲線逐層閉合傷口，接著行髖人字石膏固定（傷口處保持5 cm開窗）；而假手術(shù)組選擇相同位置及長度切開顯露股靜脈，但不鉗夾，按相同操作關閉傷口及保持石膏外固定。術(shù)后24 h拆除髖人字石膏，按原切口暴露后肉眼觀察，同時配合HE染色法共同判定血栓形成。隨機選取27只經(jīng)造模成功后按隨機數(shù)字表法分為消栓飲組（A 組）、低分子肝素鈉組（B 組）、模型組（C 組）3 組，剩余18只均分為假手術(shù)組（D組）及空白對照組（E組）；分組完畢后，測量發(fā)現(xiàn)各組大白兔體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），提示組間均衡性好。

1.4 干預方法 通過人兔等效劑量換算，得出A組大白兔消栓飲灌胃量為9.9 g/（kg·d），每日2次；B組大白兔予以腹壁皮下注射低分子肝素鈉，每支用40 mL 5%葡萄糖溶液稀釋，40 IU/（kg·次），每日 1 次；C、D、E組予以等劑量0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日2次。各組于第1、3、7天第2次灌胃4 h后每次隨機選取3只大白兔進行股靜脈取樣及腹主動脈采血。

1.5 標本采集與檢測 1）將腹主動脈血保存于EDTA管，靜置、離心后，采用ELISA檢測血清NF-κB值。2）采用 RT-PCR法檢測股靜脈中 NF-κB p65 mRNA、IKBa mRNA相對表達量，HE染色進行組織學分析；具體方法如下，進行股靜脈樣本采集后，近端0.5 cm進行組織學鑒定，余下部分按照Trizol試劑盒要求進行總RNA提取及cDNA鏈合成，最后按95℃，3 min預變性；95℃，5 s變性；56℃，10 s退火；72℃，25 s延伸；39℃循環(huán)的反應條件進行PCR擴增，以2-△△Ct結(jié)果形式進行分析，具體如下：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）；△△Ct=△Ct（實驗組目的基因）-△Ct（對照組目的基因）。

1.6 統(tǒng)計學處理 應用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較時采用單因素方差分析，符合正態(tài)性分布檢驗及方差齊性檢驗，選LSD檢驗，采用t檢驗進行組內(nèi)比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組深靜脈血栓形成后股靜脈的顏色、形態(tài)比較27只經(jīng)造模處理的大白兔術(shù)后24 h肉眼狀態(tài)下可見股靜脈顏色明顯變暗、甚至呈紫黑色，同時管腔增粗，有明顯黑色血凝塊充斥其中，甚至全節(jié)段腫脹，提示股靜脈血栓形成（圖1，2）；而假手術(shù)組的大白兔股靜脈顏色偏紅，管腔未見腫脹及凝血塊，提示無血栓形成（圖 3）。

圖1

圖2

圖3

2.2 各組HE染色結(jié)果比較 經(jīng)造模處理24 h的大白兔股靜脈HE染色可見血栓充斥管腔內(nèi)，同時與管壁黏附，散在有部分血管壁脫落的內(nèi)皮細胞（圖4），3、7 d后消栓飲組可見血栓逐漸消退，管腔部分再通（圖5、6）；假手術(shù)組僅發(fā)現(xiàn)管壁內(nèi)皮細胞脫落，未見血栓形成（圖 7）。

圖4

圖5

圖6

圖7

2.3 各組兔靜脈壁NF-κB p65水平比較 見表1。術(shù)后同時期D、E組NF-κB p65水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），D 組組內(nèi)比較差異統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；術(shù)后 1 d，A、B、C 組的 NF-κB p65含量高于 D 組（P＜0.05）；A、B、CNF-κB p65 mRNA 水平組內(nèi)比較， 其差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；A、B組與C組在同時期相比（P＜0.01）；A、B兩組在同時期相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 各組靜脈壁NF-κB p65 mRNA相對表達量比較（±s）

表1 各組靜脈壁NF-κB p65 mRNA相對表達量比較（±s）

與 D 組比較，*P＜0.05；與 C 組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與同組術(shù)后 1 d比較，#P＜0.01，與術(shù)后 3 d比較，▲P＜0.05。 下同。

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2.4 各組兔靜脈壁IKBa含量比較 見表2。術(shù)后同時期D、E組IKBa mRNA水平相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），D 組組內(nèi)差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）；術(shù)后1 d，A、B、C組的IKBa mRNA含量低于D組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）；A、B、CIKBa mRNA 水平組內(nèi)比較，其差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；A、B組與C組在同時期相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；A、B兩組在同時期相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 各組靜脈壁IKBa mRNA相對表達量比較（±s）

表2 各組靜脈壁IKBa mRNA相對表達量比較（±s）

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2.5 各組血清NF-κB水平的比較 見表3。術(shù)后同時期D、E組NF-κB相比差異無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），D組組內(nèi)比較差異統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；術(shù)后1 d，A、B、C組的NF-κB含量均明顯高于D組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；同時 A、B、C 3 組 NF-κB 水平組內(nèi)比較，其差異均具有統(tǒng)計學意義；A、B組與C組在同時期相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；A、B 兩組在同時期相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表3 各組血清NF-κB OD值比較（±s）

表3 各組血清NF-κB OD值比較（±s）

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3 討 論

目前，DVT已經(jīng)成為骨科大手術(shù)術(shù)后嚴重影響患者生活質(zhì)量甚至導致死亡的重要并發(fā)癥之一，合理、個體化、足療程的抗凝治療仍是骨科術(shù)后DVT的重要預防措施［4-5］。低分子肝素鈉是由低分子量的肝素解聚而成，臨床實驗證明低分子肝素鈉在常規(guī)的預防劑量下不會顯著改變活化部分凝血酶時間，在多年的臨床實踐中被認為是國內(nèi)應用最廣泛而且安全可靠的抗凝藥物。

研究表明炎癥反應與血栓形成密不可分［6］。Rabinovich A等［7］指出，血栓形成后可以直接引起血管壁的炎癥反應，包括白細胞的聚集、活化及炎癥因子的表達等，造成血管內(nèi)膜的損傷，導致血液高凝，進一步加重血栓形成。NF-κB作為一種多靶點的核轉(zhuǎn)錄因子，是多種炎性反應過程的樞紐和中心環(huán)節(jié)［8］，其生物學活性取決于p65/p50與IKBa蛋白的降解和轉(zhuǎn)移。NF-κB廣泛參與機體應激反應及炎癥反應，目前臨床上已有大量藥物的抗炎治療被證實是通過抑制NF-κB的表達而實現(xiàn)的，例如糖皮質(zhì)激素［9］。NF-κB信號通路的活化調(diào)控炎癥介質(zhì)、細胞因子的釋放，介導炎癥反應，NF-κB的表達水平同樣能反映炎癥的變化趨勢，在炎癥相關性疾病中作為疾病發(fā)展、轉(zhuǎn)歸的生物學標志。

近年有關NF-κB信號通路與DVT的研究大都是通過中斷NF-κB調(diào)控的炎癥反應來減少血栓的形成［10］。NF-κB通路引起血栓形成機制大體如下：外界因素的刺激使得發(fā)生核轉(zhuǎn)移的NF-κB增強了靶基因表面的DNA結(jié)合位點，促進黏附因子、細胞因子、各種酶的釋放，血管內(nèi)皮細胞作為NF-κB各種群重要表達區(qū)域，首先受到各種細胞因子的沖擊，受損后的血管內(nèi)皮出現(xiàn)凝血功能的紊亂，大量的血小板、白細胞、中性粒細胞過度聚集、黏附，造成血管壁的進一步損傷及血液高凝，誘發(fā)血栓形成；閻偉證實了NF-κB的活化能調(diào)控大鼠血栓的發(fā)展，通過阻止NF-κB的表達來減輕中性粒細胞對內(nèi)皮細胞的反應，體現(xiàn)了從炎癥-血栓途徑的血管內(nèi)皮保護機制［11］。本實驗發(fā)現(xiàn)，在血栓形成后，模型組NF-κB p65 mRNA較空白組明顯上升，而IKBa mRNA水平下降，提示血管內(nèi)皮損傷后激活了NF-κB信號通路，調(diào)控炎性損傷，表明NF-κB激活調(diào)控的炎癥反應在DVT發(fā)生過程中發(fā)揮關鍵性作用。

消栓飲全方以黃芪為君，取其甘溫益氣，通利血脈，氣盛血自行，祛瘀不傷正，桂枝溫經(jīng)通脈，除血痹，與黃芪相伍，益氣溫陽，營衛(wèi)氣血和利，脈絡充盛。白芍入營理血，與桂枝合用，增強和營通脈之功；丹參、歸尾補血活血，祛瘀不傷血，牛膝宣散降逆，下血通脈，并引諸藥下行，大腹皮、陳皮、枳殼，能寬中除滿，行氣導滯；茯苓、豬苓、澤瀉利水滲濕，與桂枝同用，又有溫陽化氣散水氣之功；甘草調(diào)和諸藥。全方合用補而不滯，行而不傷，共奏益氣活血、消栓通脈之功。

在前期大量科研實驗證明其改善血液流變學指標、抗凝、促纖溶的作用與治療創(chuàng)傷性深靜脈血栓緊密相連［12-16］。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)消栓飲干預后的兔靜脈壁NF-κB p65 mRNA及血清NF-κB表達顯著下降，IKBa mRNA表達上升，提示消栓飲可以有效調(diào)控血栓形成后NF-κB介導的炎癥反應，抑制NF-κB信號傳導通路，降低靜脈壁中NF-κB p65及血清NF-κB表達、促進IKBa表達，從而減輕血管壁炎性損傷，加速修復；提示調(diào)控NF-κB信號通路是消栓飲治療深靜脈血栓的途徑之一。

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