益氣通脈解毒方對急性心肌梗死大鼠心肌梗死面積及VEGF和bFGF蛋白表達(dá)的影響*

陳 寧 徐春梅

（1.山東省青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，山東 青島 266200；2.山東省青島市即墨區(qū)人民醫(yī)院，山東 青島 266200）

心肌梗死為多發(fā)性心血管病，急性心肌梗死是由于冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，激活血小板和凝血，形成血栓完全阻塞冠狀動脈所致，是嚴(yán)重危害人們健康的疾?。?-2］。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）可形成新的血管，增加血管的通透性，是目前最廣泛治療性血管新生的因子之一［3-4］。堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）可促進(jìn)成纖維細(xì)胞、對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長、對內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的分泌，促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞的生長［5］。在心肌缺血缺氧的條件下，在周圍的受損心肌細(xì)胞中均有VEGF和bFGF的表達(dá)增高。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為瘀血阻絡(luò)、氣虛血瘀是導(dǎo)致急性心肌梗死的主要原因，治宜活血化瘀［6］。益氣通脈解毒方為青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院治療急性心肌梗死的院內(nèi)協(xié)定處方，具有活血益氣、化瘀解毒功效，具有較好的臨床療效，但其作用機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在觀察益氣通脈解毒方對急性心肌梗死大鼠心肌梗死面積及VEGF和bFGF蛋白表達(dá)的影響并探討其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 30只健康雄性清潔級Wistar大鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，動物許可證號：SCXK（京）2011-0011。 雌雄各半，體質(zhì)量（250±20）g。自然光線，分籠飼養(yǎng)，以標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌蒸餾水喂養(yǎng)。

1.2 試藥與儀器 益氣通脈解毒方：黃芪20 g，丹參15 g，川芎 20 g，赤芍 10 g，紅花 10 g，延胡索 10 g，莪術(shù) 10 g，三棱 10 g，黃連 10 g，葛根 10 g，甘草 10 g。 藥材均為本院中藥房提供，取處方藥材，加8倍量水煎煮2次，濾過，并制成生藥含量1 g/mL的煎煮液。水合氯醛 （國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），HE染色液（Sigma公司），VEGF和bFGF單克隆抗體試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。倍他樂克片（阿斯利康制藥有限公司，規(guī)格：25 mg/片。批號：20170216）。注射用青霉素鈉（江西東風(fēng)藥業(yè)股份有限公司，規(guī)格：80萬單位。批號：20170309）

1.3 模型制備 30只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。水合氯醛麻醉大鼠后，固定于手術(shù)臺，碘酒消毒，在左胸第4與第5肋骨間作橫切口，打開胸腔，使心臟充分暴露于外，剪開心包，無創(chuàng)縫線結(jié)扎冠狀動脈左前降支，心肌稍微變白、心臟搏動稍減弱，心電圖出現(xiàn)ST段上抬，抬高到弓背向上為造模成功。然后上少許青霉素面劑，逐層縫合皮膚，清除術(shù)野，關(guān)閉切口。腹腔注射青霉素 3 d，200 萬/（kg·d），預(yù)防感染［7］。

1.4 分組與給藥 將成模大鼠隨機(jī)分為中藥組、西藥組與模型組，每組10只。中藥組給予益氣通脈解毒方灌胃，5 mL/kg，每日1次。西藥組給予倍他樂克灌胃，劑量為4.5 mg/kg，每日1次。模型組給予0.9%氯化鈉注射液灌胃，5 mL/kg，每日1次。連續(xù)灌胃4周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 1）測定左室收縮內(nèi)徑、左室舒張內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率。灌胃4周后，麻醉后脫毛膏與備皮刀將左胸部殘余毛發(fā)清除，進(jìn)行也臟功能測定，取左心室分別測定左室收縮內(nèi)徑、左室舒張內(nèi)徑、左室射血分?jǐn)?shù)和左室短軸縮短率。2）觀察梗死面積。檢測完心功能后，剪開胸腔，迅速取出心臟，生理鹽水清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色。固定后的心臟左心室心肌沿短軸橫切成2 mm厚薄片，置入含0.5%NBT pH7.4的磷酸鹽緩沖液，37℃恒溫水浴染色15 min，觀察梗死面積。3）免疫組化法檢測VEGF和bFGF蛋白表達(dá)。取組織切片，消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，蒸餾水沖洗，切片常規(guī)脫蠟、水化，按免疫組化試劑盒提供的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。圖象分析系統(tǒng)觀察結(jié)果，隨機(jī)測定5個視野，計(jì)算每100倍視野中平均灰度值，取其均值為該切片灰度值，代表該組織內(nèi)VEGF和bFGF蛋白含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以 n（%）表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較 見表1。4周后，中藥組的左室短軸縮短率和左室射血分?jǐn)?shù)高于對照組，左室舒張內(nèi)徑和左室收縮內(nèi)徑低于對照組（P＜0.05），但與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠心功能指標(biāo)比較（±s）

與模型組比較，△P＜0.05。下同。

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2.2 各組大鼠病理組織比較 見圖1。模型組大鼠心肌細(xì)胞壞死，細(xì)胞核溶解、消失，纖維結(jié)締組織增生，炎癥細(xì)胞浸潤，中藥組和西藥組也肌細(xì)胞壞死減少，纖維組織增生較少，少量炎癥細(xì)胞浸潤。西藥組與中藥組比較無明顯變化。

2.3 各組大鼠心肌梗死面積比較 見表2。中藥組與西藥組心肌梗死面積均顯著低于模型組（P＜0.05），但中藥組與西藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠心肌組織病理改變比較（HE染色，100倍）

表2 各組大鼠VEGF和bFGF蛋白表達(dá)及心肌梗死面積比較（μm2，±s）

表2 各組大鼠VEGF和bFGF蛋白表達(dá)及心肌梗死面積比較（μm2，±s）

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2.4 各組VEGF和bFGF蛋白表達(dá)比較 見表2，圖2～3。中藥組和西藥組的VEGF和bFGF蛋白水平高于模型組（P＜0.05），但中藥組與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠VEGF蛋白表達(dá)情況比較（HE染色，400倍）

圖3 各組大鼠bFGF蛋白表達(dá)情況比較（HE染色，400倍）

3 討 論

急性心肌梗死是冠狀動脈粥樣硬化斑塊破裂，激活血小板和凝血過程，形成血栓完全阻塞冠狀動脈所致，發(fā)病率逐年増加且發(fā)病年輕化的趨勢，嚴(yán)本危害人民健康［8］。研究證實(shí)心肌凋亡心肌壞死和心肌重構(gòu)中起著重要作用，新生血管可促進(jìn)生長因子生長，與血管生成過程中多種生長因子、蛋白酶、趨化因子等有關(guān)［9］。VEGF為血管平滑肌細(xì)胞因子，可刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)微血管通透性增加，其分泌的血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子進(jìn)一步促進(jìn)炎性細(xì)胞與冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，引起CRP、TNF-α炎癥因子釋放，損害患者的心肌功能［10-11］。bFGF可促進(jìn)新生血管形成，促進(jìn)修復(fù)組織損傷，急性心肌梗死患者心肌缺血缺氧，血管平滑肌和心肌受損，引起bFGF水平降低［12］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為急性心肌梗死是氣虛血瘀所致，通暢氣血可有效改善患者的病情。益氣通脈解毒為本院心內(nèi)科治療急性心肌梗死的協(xié)定處方，方中黃芪補(bǔ)氣固表、丹參丹參為君藥，川芎、赤芍、紅花化瘀止血為臣藥，莪術(shù)、三棱性皆微溫，為化瘀血之藥，加強(qiáng)臣藥功效，黃連清熱通便，散風(fēng)止痛，葛根生津止喝，共為佐藥，甘草調(diào)和諸藥為使藥，全方具有活血益氣、化瘀解毒功效。因此，本研究旨在探討益氣通脈解毒方對急性心肌梗死大鼠心肌梗死面積及VEGF和bFGF蛋白表達(dá)的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，4周后中藥組的左室短軸縮短率和左室射血分?jǐn)?shù)高于模型組，左室舒張內(nèi)徑和左室收縮內(nèi)徑低于模型組，說明益氣通脈解毒方可改善急性心肌梗死大鼠局部病理改變。這與益氣通脈解毒方中的黃芪強(qiáng)心苷改善心室肌收縮和舒張，有效逆轉(zhuǎn)損傷心室肌密切相關(guān)［13］。中藥組和西藥組也肌細(xì)胞壞死減少，纖維組織增生較少，少量炎癥細(xì)胞浸潤，減少心肌梗死面積。益氣通脈解毒方中丹參可抑制心肌成纖維細(xì)胞分裂，川芎、紅花均活血化瘀，提高細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶的生物活性，改善局部血液循環(huán)，抑制平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增生有關(guān)［14］。中藥組和西藥組的VEGF和bFGF蛋白水平高于模型組，說明益氣通脈解毒方可提高急性心肌梗死大鼠VEGF和bFGF蛋白表達(dá)，保護(hù)損傷的心肌。川芎能促進(jìn)心肌梗死后大鼠缺血心肌血管新生，減少左心室重構(gòu)，改善心功能，莪術(shù)、三棱減少血管內(nèi)血栓形成，抑制血管內(nèi)動脈粥樣硬化進(jìn)程，保護(hù)缺血心肌，黃連、葛根擴(kuò)張冠狀動脈、減輕微血管阻力，益氣通脈解毒方提高心肌抗缺血能力，修復(fù)損傷心肌細(xì)胞，提高VEGF和bFGF蛋白表達(dá)［15］。

綜上所述，益氣通脈解毒方可改善急性心肌梗死大鼠局部病理改變及減少纖維化，減少梗死面積，提高VEGF和bFGF蛋白表達(dá)，發(fā)揮保護(hù)心肌性損傷作用。

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