加減射干麻黃湯對哮喘大鼠氣道重塑及肺組織PCNA和ERK的影響*

王晶波 張 帥

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

氣道重塑是哮喘長期反復(fù)發(fā)病和纏綿難愈的病理基礎(chǔ)，隨病情的進(jìn)展而呈現(xiàn)進(jìn)行性加重，導(dǎo)致了哮喘患者發(fā)生了不可逆的氣流阻塞以及持續(xù)性的氣道高反應(yīng)性［1］。其病理改變包括基底膜增厚、氣道上皮脆性的增加、平滑肌細(xì)胞增生肥大以及血管增生等［2］。目前，臨床上常用糖皮質(zhì)激素來治療支氣管哮喘，具有明顯的抗炎作用，但其副作用也讓患者承受了不小的痛苦。中醫(yī)藥防治哮喘的歷史悠久，前期的臨床和基礎(chǔ)研究表明，哮喘發(fā)作期由于嚴(yán)重缺氧或哮喘反復(fù)發(fā)作，其關(guān)鍵的病因病機(jī)是肺絡(luò)痰瘀互阻，據(jù)此確立治療大法是溫肺散寒，化瘀祛痰，通絡(luò)平喘，處以加減射干麻黃湯，在臨床觀察和基礎(chǔ)研究中取得了可靠的療效［3］。本實(shí)驗(yàn)研究通過借助哮喘大鼠動(dòng)物模型，以觀察加減射干麻黃湯對哮喘大鼠氣道重塑模型的影響，并通過觀察哮喘大鼠的肺組織中增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）蛋白和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）蛋白的表達(dá)，探索加減射干麻黃湯對PCNA和ERK的調(diào)控，探討該方對哮喘大鼠氣道平滑肌作用的機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只清潔級健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（120±10）g，采購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK（黑）2013-001。飼養(yǎng)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)喂養(yǎng)1周。

1.2 試藥與儀器

1）實(shí)驗(yàn)藥物。加減射干麻黃湯（組成：射干15 g，炙麻黃 10 g，地龍 10 g，生姜 15 g，細(xì)辛 3 g，半夏 15 g，紫菀15 g，款冬花15 g，五味子10 g，大棗3枚。10味中藥組成，取上述生藥，用800 mL水浸泡2 h，煮沸30 min，過濾。藥渣加600 mL水繼續(xù)煎煮20 min，過濾。合并2次濾液，濃縮至約1 g生藥/mL的溶液），地塞米松磷酸鈉注射液（批號1401261，天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份公司生產(chǎn)）。2）主要試劑及配置方法。卵蛋白（OVA，美國Sigma公司）；免疫組化試劑盒 （兔試劑盒）、ERK和PCNA原位雜交檢測試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；羊抗兔PCNA多克隆抗體（武漢博士德生物有限公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；單克隆抗體 （NeoMarkers公司）；兔抗磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）抗體、兔抗 ERK1/2單克隆抗體（R&D公司）。3）主要儀器和設(shè)備。超聲霧化器（402AI，上海魚躍醫(yī)療設(shè)備有限公司）；石蠟包埋機(jī)（LS-100，沈陽龍首電子儀器有限公司）；高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)（HMIAS-2000）；凝膠電泳成像系統(tǒng)（Gene Genius，美國）；天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)（Tanon-1600）。

1.3 分組及造模

Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組：模型對照組、空白對照組、中藥治療組、地塞米松組各15只。依據(jù)參考文獻(xiàn)并加以改良，建立哮喘大鼠模型：在實(shí)驗(yàn)的第1、15日，模型對照組、中藥治療組、地塞米松組大鼠分別腹腔注射致敏液0.2 mL（含OVA 10 μg，氫氧化鋁20 μg），空白對照組大鼠則予等量生理鹽水腹腔注射。模型對照組、中藥治療組、地塞米松組大鼠于實(shí)驗(yàn)第22日開始霧化吸入25 g/L OVA溶液，每次30 min，每日1次，持續(xù)4周，空白對照組大鼠則霧化等量0.9%氯化鈉注射液。

1.4 干預(yù)方法

實(shí)驗(yàn)第22至49日，在每次霧化吸入前0.5 h，中藥治療組用加減射干麻黃湯0.5mL灌胃，地塞米松組則腹腔注射地塞米松（0.65 mg/kg）0.26 mL，模型對照組、空白對照組腹腔注射等量生理鹽水0.26 mL［4-5］。

1.5 標(biāo)本采集與檢測

1.5.1 動(dòng)物一般狀態(tài) 在動(dòng)物造模的過程中需觀察大鼠的活動(dòng)能力、精神狀態(tài)、體質(zhì)量變化、食欲及排泄情況等；觀察霧化誘喘后大鼠有無喘息、呼吸急促等表現(xiàn)。

1.5.2 肺組織病理學(xué)檢查 4組大鼠在末次激發(fā)3 min后處死，取右肺連同右主支氣管，常規(guī)石蠟包埋處理，切成4 μm厚的薄片。HE染色，制成病理切片，顯微鏡下觀察。肺組織病理切片放大400倍，每個(gè)標(biāo)本各采取3個(gè)細(xì)支氣管完整的橫斷面的圖像，并用圖像分析軟件分別測量計(jì)算支氣管內(nèi)管壁（橫斷面）的面積（WAi）、平滑?。M斷面）的面積（WAm）、基底膜的周長（Pbm），取其平均值；并分別用Pbm對WAi和WAm進(jìn)行標(biāo)化，利用WAi/Pbm與WAm/Pbm來反映內(nèi)管壁和平滑肌厚度的變化。

1.5.3 檢測肺組織PCNA和ERK的表達(dá) 1）免疫組化法：4組大鼠處死后，開胸結(jié)扎，取出右肺，常規(guī)石蠟包埋處理，用于免疫組化。肺組織切片常規(guī)脫蠟和水化，按試劑盒說明說操作?？乖⒉嵝迯?fù)，PBS沖洗。滴加封閉液。滴加一抗，PBS沖洗3次。滴加二抗，PBS沖洗3次。滴加鏈霉素化親和素試劑，PBS沖洗4次。DAB顯色，蒸餾水洗，蘇木素復(fù)染、飽和磷氫二鈉分化。脫水、透明、封片、鏡檢。2）原位雜交法：石蠟切片脫蠟。焦碳酸二乙酯室溫下浸泡，PBS漂洗。蛋白酶K消化，PBS漂洗。HCL孵育，PBS漂洗。無水乙酸和三乙醇胺孵育，PBS漂洗。2×SSC漂洗。滴加雜交液，封口膜覆蓋，保溫。SSC洗滌，羊血清封閉。加入抗地高辛抗體，孵育。緩沖液A漂洗，緩沖液B清洗。DAB顯色、乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后用中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察每張肺組織切片中的5～7只細(xì)支氣管，并用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，測定細(xì)支氣管的灰度值，并計(jì)算其平均灰度值。陽性信號呈棕黃色沉淀。陰性信號對照片雜交時(shí)不加探針，且免去加入地高辛抗體，其余的操作程序同上。3）免疫印跡法：4組大鼠處死后，取新鮮肺組織50 mg制成細(xì)胞核蛋白，取適量蛋白配成終濃度，用于免疫印跡法檢測。制作電泳凝膠。上樣。進(jìn)行電泳。轉(zhuǎn)膜。封閉液封閉。進(jìn)行一抗孵育，二抗孵育?；瘜W(xué)發(fā)光，顯影，定影。掃描圖片。灰度分析使用凝膠圖像處理系統(tǒng)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠一般情況

與空白對照組比較，哮喘模型組大鼠精神狀態(tài)不佳，煩躁易驚，呼吸時(shí)有明顯的點(diǎn)頭現(xiàn)象，伴有噴嚏、搔鼻，二便增多。與模型對照組比較，中藥治療組和地塞米松組癥狀相對較輕，每次霧化吸入卵蛋白激發(fā)后，雖有呼吸增快、點(diǎn)頭呼吸、噴嚏現(xiàn)象，但神態(tài)較為安靜。與地塞米松組比較，中藥治療組癥狀較輕，大鼠飲水量增多，但尿量減少，大便較干。

2.2 肺組織形態(tài)學(xué)病理改變

見圖1。經(jīng)HE染色后，模型組大鼠肺組織可觀察到支氣管上皮細(xì)胞的腫脹、脫落，支氣管管壁增厚及管腔縮窄；與模型組相比，中藥治療組大鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞的腫脹較輕，脫落減少，支氣管壁及管腔縮窄不明顯，且其中的炎癥細(xì)胞數(shù)量明顯減少；空白對照組大鼠的肺組織則無明顯異常變化。

2.3 各組大鼠平滑肌標(biāo)化面積、內(nèi)管壁標(biāo)化面積比較

見表1。與空白對照組比較，模型組WAm/Pbm及WAi/Pbm明顯增加（P＜0.05）；與模型對照組比較，中藥治療組WAm/Pbm及WAi/Pbm明顯降低（P＜0.05）；與地塞米松組比較，中藥治療組WAm/Pbm及WAi/Pbm差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 免疫組化法觀察各組大鼠PCNA和ERK表達(dá)的變化

圖1 各組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)病理改變（HE染色，400倍）

表1 各組大鼠支氣管平滑肌標(biāo)化面積、內(nèi)管壁標(biāo)化面積圖像分析結(jié)果比較（±s）

表1 各組大鼠支氣管平滑肌標(biāo)化面積、內(nèi)管壁標(biāo)化面積圖像分析結(jié)果比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05。

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見圖2，圖3。經(jīng)免疫組化染色后，在各組大鼠的氣道壁均觀察到了陽性PCNA蛋白反應(yīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為圓形棕黑染色顆粒。哮喘模型組ERK呈現(xiàn)陽性表達(dá)于各組動(dòng)物氣道黏膜、氣道平滑肌、血管平滑肌及血管內(nèi)皮細(xì)胞上，空白對照組僅呈弱表達(dá)。

圖2 免疫組化法各組大鼠PCNA表達(dá)的變化（400倍）

2.5 原位雜交法觀察各組大鼠肺組織PCNA和ERK的mRNA的表達(dá)

見表2，圖4～圖5?？瞻讓φ战MPCNA和ERK基本沒有表達(dá)，哮喘模型組在細(xì)支氣管平滑肌細(xì)胞上的ERK mRNA及PCNA mRNA的陽性表達(dá)較空白對照組明顯增加，見表2。中藥治療組與地塞米松組PCNA mRNA和ERK mRNA表達(dá)較哮喘模型組明顯減少。中藥治療組PCNA mRNA和ERK mRNA表達(dá)與地塞米松組相當(dāng)。

圖3 免疫組化法各組大鼠ERK表達(dá)的變化（400倍）

表2 各組大鼠氣道平滑肌PCNA mRNA、ERK mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠氣道平滑肌PCNA mRNA、ERK mRNA表達(dá)比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，△P＜0.05。

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圖4 原位雜交法各組大鼠PCNA表達(dá)的變化（400倍）

2.6 免疫印跡法測定肺組織PCNA、ERK和p-ERK蛋白 見表3。與空白對照組比較，哮喘模型組PCNA、p-ERK、ERK 蛋白的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與哮喘模型組比較，中藥治療組PCNA、p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；與地塞米松組比較，中藥治療組PCNA、p-ERK、ERK蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）。

圖5 原位雜交法各組大鼠ERK表達(dá)的變化（400倍）

表3 各組大鼠肺組織中p-ERK及ERK表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠肺組織中p-ERK及ERK表達(dá)比較（±s）

與空白對照組比較，*P＜0.05；與模型對照組比較，#P＜0.05；與地塞米松組比較，△P＜0.05。

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3 討 論

哮喘氣道重建主要病理變化為上皮脫落，氣道平滑肌層的增生、肥大以及基底膜增厚等［6］。大量研究證實(shí)，在氣道重塑和氣道高反應(yīng)中存在多種細(xì)胞因子作用于氣道平滑肌細(xì)胞，使其變得增生和肥大，從而造成氣道壁增厚，使氣道狹窄更為嚴(yán)重，最終導(dǎo)致氣道重塑及氣道高反應(yīng)性；另外，氣道平滑肌細(xì)胞自身增生肥大的同時(shí)還分泌多種細(xì)胞因子、表達(dá)黏附分子等，作用于炎性細(xì)胞而表現(xiàn)出免疫效應(yīng)。PCNA是一種在細(xì)胞核內(nèi)合成并儲存的蛋白質(zhì)，受ERK信號通路調(diào)控，其表達(dá)情況可作為評估組織中細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)可靠指標(biāo)。ERK參與調(diào)控ASMC的表型轉(zhuǎn)化、遷移、增殖、凋亡和分泌等多種生理功能［7］。大鼠 ASMCs 增殖的調(diào)控［8］及免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)中均有ERK的參與。已有研究發(fā)現(xiàn)，ERK 1/2在氣道平滑肌上分布較為廣泛，這表明ASMCs增殖在哮喘氣道重塑中起重要作用［9］。慢性哮喘患者，其氣道中ERK 1/2持續(xù)或過度活化加重了氣道炎癥、氣道重構(gòu)，從而使氣道高反應(yīng)性更為明顯，這已成為哮喘氣道高反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展的分子基礎(chǔ)［10］。

氣道重塑是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)描述的哮喘氣道病理形態(tài)的改變，中醫(yī)學(xué)中無此方面的直接稱謂，但氣道內(nèi)的異常分泌物及炎性滲出阻滯氣道與中醫(yī)理論有形之痰壅阻肺絡(luò)相類似；氣道平滑肌及血管上皮細(xì)胞的增生、氣道黏液腺體的異常增生導(dǎo)致的氣道阻滯與中醫(yī)理論無形之痰壅阻肺絡(luò)相類似?？梢娤摹百砀迸c氣道重塑的關(guān)系非常密切?！栋Y因脈治》云“哮病之因，痰飲留伏，結(jié)成巢臼，潛伏于內(nèi)”。究其實(shí)質(zhì)可能與“痰飲”“外邪伏藏于肺”“痰瘀互阻”“臟腑失調(diào)”等多種因素密切相關(guān)。概而言之，夙根的形成是本虛標(biāo)實(shí)，本虛為臟腑虧虛，標(biāo)實(shí)為痰飲、瘀血、外邪所致。故而依據(jù)臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，確立了溫肺散寒，化瘀祛痰，通絡(luò)平喘之法，自擬加減射干麻黃湯，在溫肺散寒的基礎(chǔ)上，加入活血通絡(luò)之品地龍，體現(xiàn)了《黃帝內(nèi)經(jīng)》“治未病”理論?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)射干麻黃湯有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘作用，能明顯擴(kuò)張支氣管平滑肌和對抗乙酰膽堿對氣管平滑肌的收縮作用。隋博文等研究證實(shí)射干麻黃湯可減少哮喘小鼠Th17 細(xì)胞數(shù)，增加 CD4+～CD25+～Treg 細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而調(diào)節(jié)Th17/CD4+～CD25+～Treg的免疫紊亂從而延緩氣道重塑［11］。曹琿證實(shí)射干麻黃湯可以有效抑制哮喘大鼠的 TNF-α、IL-17質(zhì)量濃度達(dá)到抑制炎癥的目的［12］。 本方在射干麻黃湯基礎(chǔ)上加入通絡(luò)平喘之地龍，能夠擴(kuò)張支氣管、緩解支氣管痙攣，有良好的止咳平喘作用［13］。唐秋鳳等研究證實(shí)地龍能夠減少哮喘小鼠BALF中炎性細(xì)胞數(shù)，并且可減少膠原蛋白沉積、抑制杯狀細(xì)胞增生以及黏液分泌［14］。李祥華等證實(shí)地龍湯水煎液對氣道變態(tài)反應(yīng)性炎癥有抗變態(tài)反應(yīng)的作用，對組胺所致過敏性哮喘有阻抗作用［15］。余國英等用自擬地龍湯（含地龍）治療老年支氣管哮喘發(fā)作期患者30例，療程1個(gè)月，總有效率為 93.33%［16］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，中藥治療組能改善哮喘大鼠氣道內(nèi)管壁面積、氣道平滑肌面積，經(jīng)HE染色后肺組織支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)較輕，支氣管壁及管腔內(nèi)的炎癥細(xì)胞也顯著減少，提示加減射干麻黃湯能夠使氣道管壁厚度和平滑肌增生減輕，使哮喘氣道重塑的過程得以改善。哮喘模型組支氣管平滑肌的PCNA mRNA和ERK mRNA陽性表達(dá)顯著增加，且PCNA、ERK蛋白、p-ERK蛋白表達(dá)也明顯增加，且三者呈正相關(guān)性，表明ERK的活化與哮喘氣道重塑中氣道平滑肌的增殖過程有關(guān)。經(jīng)應(yīng)用加減射干麻黃湯后，中藥治療組PCNA、ERK、p-ERK1/2陽性表達(dá)明顯減少，且PCNA、ERK蛋白、p-ERK蛋白表達(dá)明顯減低，提示ERK的活化可能參與了氣道平滑肌增殖，進(jìn)而導(dǎo)致哮喘氣道重塑的發(fā)生發(fā)展。

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，加減射干麻黃湯能夠抑制氣道重塑的機(jī)制可能是通過降低PCNA的水平，以及抑制ERK、p-ERK、PCNA蛋白表達(dá)水平，抑制氣道平滑肌增殖，從而達(dá)到改善哮喘大鼠氣道重塑的目的。

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