解郁安神顆粒中柴胡皂苷含量測(cè)定方法研究*

林 華，黃興振

（1.廣西壯族自治區(qū)柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545006； 2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530000）

柴胡 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.別名山柴胡、山菜、柴草，是中國(guó)傳統(tǒng)的藥用植物，具有兩千多年的藥用歷史。具有疏肝解郁、解表退熱和升舉陽(yáng)氣等功效[1-2]，經(jīng)現(xiàn)代藥理學(xué)與臨床試驗(yàn)證實(shí)，具有保肝、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等作用。研究發(fā)現(xiàn)，柴胡中含五環(huán)三萜類皂苷多達(dá)100多種，其中含量較多的為柴胡皂苷a，c，d[3-8]，主要藥理活性的物質(zhì)為柴胡皂苷 a，d[9-13]。目前，以柴胡皂苷為主的單味及復(fù)方制劑，如解郁安神顆粒、柴胡口服液、逍遙丸等，臨床應(yīng)用比較廣泛，療效顯著。柴胡藥材中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量已成為檢驗(yàn)其質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。

近年來(lái)，以柴胡為主藥的中成藥多采用薄層色譜法，以柴胡原藥材作為對(duì)照品對(duì)其進(jìn)行定性鑒別。在含有柴胡的諸多中成藥中，對(duì)于柴胡皂昔a，d的含量測(cè)定研究并不多見，這是由于柴胡皂苷中的雙鍵數(shù)目較少，且柴胡皂苷a，d十分不穩(wěn)定，在高溫或酸性條件下很容易發(fā)生開環(huán)反應(yīng)而降解[14-15]。因此，傳統(tǒng)的檢測(cè)手段較復(fù)雜，在生產(chǎn)過程中，更傾向于選擇芍藥苷、黃芩苷、甘草次酸等組分的含量作為測(cè)定指標(biāo)。此外，還有利用大孔樹脂柱對(duì)中成藥進(jìn)行處理，從而間接地測(cè)定其中柴胡皂苷的含量，但這些方法均存在方法繁復(fù)、耗時(shí)耗材等缺陷。對(duì)于含柴胡的中成藥，尚未建立以柴胡皂苷含量為指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法。

中成藥解郁安神顆粒由柴胡、丹皮、大棗、石菖蒲等多種藥材制成，有舒肝解郁、燥濕化痰、安神定志等功效，是一種典型的以柴胡皂苷a，d為主要藥用成分的中成藥[16-18]。因此，本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)解郁安神顆粒中柴胡皂苷a，d的含量，具有柱效高、靈敏度高、分離時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[19-22]。同時(shí)，本研究中對(duì)測(cè)定柴胡皂苷的HPLC法進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證，旨在建立一個(gè)重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)的檢測(cè)柴胡皂苷的方法，不僅為解郁安神顆粒中柴胡皂苷含量的測(cè)定提供了可靠的方法，同時(shí)對(duì)加強(qiáng)以柴胡皂苷作為有效成分的中成藥的質(zhì)量控制提供了參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津2010高效液相色譜儀，紫外可見檢測(cè)器（日本島津公司）；Milli-Q direct超純水（美國(guó)Millipore公司）；RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，B-220型恒溫水浴鍋 （上海亞榮生化儀器廠）；AB 256-S型梅特勒電子天平（Mettler Toledo）。

1.2 試藥

解郁安神顆粒（神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)為14060717，14061412，14070415）；柴胡皂苷 a 對(duì)照品（批號(hào)為 110777-201206）、柴胡皂苷 d對(duì)照品（批號(hào)為110777-201206），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇、乙腈均為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ThermoHypersilBDSC18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：水（A 相），乙腈（B 相），梯度洗脫（見表 1）；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；柱溫：25℃；進(jìn)樣室溫度：15℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取柴胡皂苷a對(duì)照品約2.88 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為576 μg/mL的柴胡皂苷a對(duì)照品溶液。取柴胡皂苷d對(duì)照品約3.24 mg，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為648 μg/mL的柴胡皂苷d對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取待測(cè)樣品約1.24 g，精密稱定，置100 mL錐形瓶中，加30 mL 10%氨水-甲醇溶液，超聲提取 30 min，離心 10 min，速率為 3 000 r/min。收集上清液，繼續(xù)提取2次。將3次提取所得上清液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮、干燥，得濃縮物。將得到的濃縮物置燒杯中，加10 mL水使其溶解，移入分液漏斗，加30 mL飽和正丁醇，混勻，靜置分層，收集醇層至另一錐形瓶，連續(xù)萃取2次。將萃取液合并，繼續(xù)加30 mL氨水，靜置分層，取醇層，重復(fù)3次。將醇萃取液經(jīng)旋蒸儀濃縮，干燥，加適量甲醇溶解，轉(zhuǎn)至10 mL容量瓶，加甲醇定容，搖勻備用。

陰性對(duì)照品溶液：按處方比例自制不含柴胡的顆粒，作為陰性對(duì)照品，再按供試品溶液的配制方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

干擾試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各20 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，供試品溶液中其他成分不干擾測(cè)定。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：取配制好的2.2項(xiàng)下柴胡皂苷a對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為10，20，40，80，160，240，320 μg/mL 的對(duì)照品溶液。同樣取適量2.2項(xiàng)下柴胡皂苷d對(duì)照品溶液，稀釋成質(zhì)量濃度分別為 10，20，40，80，160，240，320 μg/mL 的對(duì)照品溶液。HPLC分析，記錄峰面積。以對(duì)照品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)計(jì)算回歸方程。柴胡皂苷a質(zhì)量濃度在 20.25 ～311.46 μg/mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為 Y=2.31×106X+1.86×103，r=0.999 7（n=7）；柴胡皂苷 d 質(zhì)量濃度在 23.12～308.56 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為 Y=4.18 ×106X+2.13 ×103，r=0.999 6（n=7）。

精密度試驗(yàn)：取柴胡皂苷a對(duì)照品溶液與柴胡皂苷d對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣20 μL，依法連續(xù)測(cè)定6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果柴胡皂苷a的 RSD為1.46%（n=6），柴胡皂苷d的 RSD為2.67%（n=6），表明儀器精密度較好。

表2 柴胡皂苷a及柴胡皂苷d加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取適量2.2項(xiàng)下供試品溶液，室溫條件下靜置 1 d，分別于 0，4，8，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果柴胡皂苷a的 RSD為3.38%（n=5），柴胡皂苷d的 RSD為4.86%（n=5），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批（批號(hào)為14060717）樣品5份，按2.2項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析，記錄峰面積。結(jié)果柴胡皂苷 a，d的 RSD 分別為 1.63%和 3.05%（n=5），表明該方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：稱取同一批（批號(hào)為14060717）樣品6份置錐形瓶中，分別加適量柴胡皂苷a，d對(duì)照品溶液，依2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，檢測(cè)柴胡皂苷a，d的含量。結(jié)果見表2。

2.4 樣品含量測(cè)定

取樣品（批號(hào)分別為 14060717，14061412，14070415），按2.2項(xiàng)下方法制備溶液，測(cè)得3批樣品中柴胡皂苷a的含量分別為 0.77，0.74，0.81 mg/g，柴胡皂苷 d 的含量分別為 1.54，1.47，1.68 mg/g。

3 討論

3.1 提取溶劑選擇

由柴胡皂苷a，d的結(jié)構(gòu)可知，柴胡皂苷a，d很容易受到酚類及酸性組分的干擾而使環(huán)氧醚鍵斷裂，降解生成柴胡皂苷b1，b2。因此，本研究中在對(duì)解郁安神顆粒中的柴胡皂苷a，d的提取過程中以甲醇作為提取溶劑，既保證了柴胡皂苷a，d在溶劑中有足夠的溶解度，又利用了氨水的堿性，中和了解郁安神顆粒中其他酸性成分，避免了柴胡皂苷a，d在提取過程中的降解。同時(shí)，本研究中采用超聲的方法對(duì)柴胡皂苷a，d進(jìn)行提取，超聲提取法具有提取效率高、提取溶劑用量少且提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，達(dá)到了提取高效、迅速的目的。

3.2 萃取溶劑選擇

分析柴胡皂苷a，d的理化性質(zhì)可知，兩者在水或水飽和的正丁醇溶液中的溶解度較大，難溶于或不溶于苯、乙醚、氯仿等溶劑。因此，本研究中在對(duì)柴胡皂苷a，d進(jìn)行粗提取后，又進(jìn)一步通過液-液萃取的方式進(jìn)行除雜。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過正丁醇對(duì)胡皂苷a，d進(jìn)行萃取后，能除去粗提物中的酸性干擾成分，分離效果良好。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

在柴胡皂苷的結(jié)構(gòu)中，雙鍵的個(gè)數(shù)很少或無(wú)雙鍵，故本試驗(yàn)制備柴胡皂苷a的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用紫外分光光度計(jì)于200～400 nm波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，溶液在210 nm波長(zhǎng)附近有最大吸收。因此，檢測(cè)時(shí)，選擇末端吸收210 nm對(duì)柴胡皂苷進(jìn)行檢測(cè)。

3.4 流動(dòng)相選擇

首先，由于柴胡皂苷a，d均為紫外末端吸收，當(dāng)選擇甲醇作為流動(dòng)相時(shí)，此時(shí)甲醇的本底與試驗(yàn)中所采用的檢測(cè)波長(zhǎng)相近，會(huì)對(duì)柴胡皂苷的測(cè)定造成較明顯的干擾。因此，本試驗(yàn)選擇乙腈-水作為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。其次，由于柴胡皂苷a，c，d 3種成分的極性差異較大，同時(shí)，在解郁安神顆粒中還含有其他化學(xué)組分，故利用等度流動(dòng)相進(jìn)行洗脫時(shí)不能使全部樣品的柴胡皂苷a，d得到良好分離，故采取梯度洗脫。

3.5 樣品含量測(cè)定方法選擇

由對(duì)柴胡皂苷a，d含量測(cè)定的結(jié)果可見，在梯度洗脫過程中，柴胡皂苷a首先被洗脫出來(lái)，隨著流動(dòng)相中乙腈比例的不斷增加，柴胡皂苷d被洗脫出來(lái)，兩者在此液相條件下可以完全分離。究其原因，可能與柴胡皂苷a，d的理化性質(zhì)有關(guān)，雖然從所含有的官能團(tuán)的種類與數(shù)量看，柴胡皂苷a，d均相同，但是比較兩者的結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)，柴胡皂苷a，d是一對(duì)立體異構(gòu)體，16位的—OH的立體構(gòu)型。因此，立體結(jié)構(gòu)的不同可能導(dǎo)致了兩者出峰時(shí)間的差異。

解郁安神顆粒是以柴胡作為君藥，丹皮、大棗等作為佐藥，柴胡的有效物質(zhì)成分中柴胡皂苷a，d含量最多，藥理活性更明顯，柴胡皂苷a，d的含量成為中成藥解郁安神顆粒的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。柴胡皂苷a，d的結(jié)構(gòu)中均存在氧環(huán)，而且不飽和雙鍵極少，故柴胡皂苷a，d的氧環(huán)極易在酸性條件下開環(huán)降解，兩者的提取需在弱堿性條件下操作，并于210 nm紫外波長(zhǎng)下檢測(cè)。

3.6 研究?jī)r(jià)值

本研究中建立了同時(shí)測(cè)定解郁安神顆粒中柴胡皂苷a，d含量的HPLC法，可用于解郁安神顆粒中柴胡部分的質(zhì)量控制。由于含有柴胡的中成藥成分較為復(fù)雜，決定了這類藥物在質(zhì)量控制過程中存在一定的缺陷，如果中成藥的質(zhì)量檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)不具有專屬性與代表性，那就無(wú)法從根本上控制中成藥的質(zhì)量。因此，本研究中為實(shí)現(xiàn)含有柴胡的中藥制劑的質(zhì)控奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)，為建立以柴胡皂苷含量為指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)提供了重要參考，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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