血清缺血修飾白蛋白與大鼠應(yīng)激性心肌病相關(guān)性分析

尹元立，高永紅

隨著社會(huì)生活節(jié)奏的加快及工作壓力增大，心臟不良事件發(fā)生率逐年增加且有年輕化趨勢(shì)，尤其在發(fā)達(dá)國(guó)家更為明顯[1]；原因之一是在各種強(qiáng)烈的應(yīng)激因素如熬夜、不良負(fù)面情緒等刺激下導(dǎo)致體內(nèi)兒茶酚胺急劇分泌[2,3]，造成心臟結(jié)構(gòu)和功能異常，誘發(fā)應(yīng)激性心肌?。═TC）?，F(xiàn)有研究認(rèn)為該疾病具有較嚴(yán)重的并發(fā)癥如惡性心律失常、心臟破裂，甚至猝死發(fā)生[4]，所以被廣泛關(guān)注。因此深入研究該疾病的發(fā)病機(jī)制，對(duì)于降低心臟不良事件發(fā)生具有重要意義。

TTC常表現(xiàn)為心電圖ST段抬高伴有心肌酶升高，左心室可呈氣球樣膨脹，而冠狀動(dòng)脈未見(jiàn)明顯狹窄。已有研究發(fā)現(xiàn)腦利鈉肽（BNP）及肌鈣蛋白I（CTN-I）與該疾病相關(guān)[5]，但遺憾的是臨床中常用檢測(cè)手段，不能確定該疾病嚴(yán)重程度及心肌細(xì)胞損傷程度，故缺少臨床診斷及預(yù)后判斷價(jià)值。本研究發(fā)現(xiàn)缺血修飾白蛋白（IMA）在該疾病早期即可表達(dá)升高，且與該疾病發(fā)生后心肌細(xì)胞損傷程度及疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)大鼠均購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，所有的動(dòng)物護(hù)理和程序符合美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的指導(dǎo)方針，氯化鈷（CoCl2.6H2O 美國(guó)AMRESCO），二硫蘇糖醇（DTT Pharmabiology），722分光光度計(jì)（上海域儀器廠），酶促試劑盒購(gòu)自北京冬歌生物，大鼠心電圖機(jī)（湖南鼠行RM6280C），ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)西門(mén)子）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 心肌病動(dòng)物模型制備雄性SD大鼠（220～250 g，8周）120只按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組，空白組與對(duì)照組各30只，TTC組60只。其中TTC組給予大鼠異丙腎上腺素（100 mg/kg/d）不同部位多點(diǎn)皮下注射，持續(xù)3周心臟彩超驗(yàn)證心臟外形呈現(xiàn)“章魚(yú)簍”且伴有心室中段及心尖部運(yùn)動(dòng)減弱證實(shí)造模成功，造模成功后停止異丙腎上腺素注射并正常進(jìn)食飼養(yǎng)1周；對(duì)照組給予大鼠生理鹽水（100 mg/kg/d）不同部位多點(diǎn)皮下注射持續(xù)3周，3周后停止注射生理鹽水并正常進(jìn)食飼養(yǎng)1周；空白組：無(wú)干預(yù)措施。

1.2.2 大鼠心電圖及心臟超聲檢測(cè)分別在實(shí)驗(yàn)第3周及第4周對(duì)各組大鼠進(jìn)行心電圖及心臟超聲測(cè)量大鼠心尖段，心中間段及心基底段的短軸收縮率（FS），大鼠左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd），射血分?jǐn)?shù)（EF）及心電圖變化評(píng)價(jià)心臟功能。

1.2.3 檢測(cè)大鼠缺血修飾白蛋白（IMA）及心肌損傷標(biāo)準(zhǔn)物水平分別在實(shí)驗(yàn)第1、2、3周用Bar-Or's方法通過(guò)ACB測(cè)試來(lái)測(cè)量IMA的水平，取大鼠血清200 μl放于試管中，再加0.1%如氯化鈷50 μl攪勻后加入DTT 50 μl，靜置2 min后加入0.9%氯化鈉1 ml，將其與不含DTT的血清-鈷空白對(duì)比并記為吸光度單位（ABS）。分別在實(shí)驗(yàn)第1、2、3周取各組大鼠血液，血液凝結(jié)后將樣品離心，并將血清立即儲(chǔ)存在-80℃?zhèn)溆?。使用美?guó)西門(mén)子ADVIA2400全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)心肌損傷標(biāo)準(zhǔn)物肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）及肌鈣蛋白I（cTn-I）水平。

1.2.4 心肌損傷組織學(xué)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)第3、4周分別處死半數(shù)大鼠，取心臟組織標(biāo)本固定在10%中性福爾馬林溶液中并包埋在石蠟中，用HE染色分析心臟組織損傷情況，并根據(jù)組織損傷程度進(jìn)行評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下（表1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（±s），多組比較采用F檢驗(yàn)；兩兩比較t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 HE染色心肌組織損傷評(píng)分表

圖2 各組實(shí)驗(yàn)大鼠心電圖比較

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 心電圖及心臟超聲檢查結(jié)果通過(guò)持續(xù)異丙腎上腺素注射誘導(dǎo)制備TTC大鼠模型，應(yīng)用心臟彩超觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物心臟結(jié)構(gòu)改變發(fā)現(xiàn)，TTC組與空白組及對(duì)照組比較明顯出現(xiàn)左心室中段膨出，且伴有心電圖ST段明顯抬高（P＜0.05），去除應(yīng)激因素正常飼養(yǎng)1周后，左室形態(tài)恢復(fù)且心電圖ST段回落趨于正常（圖1～2）。同時(shí)通過(guò)心臟功能測(cè)定發(fā)現(xiàn)，TTC組與空白組及對(duì)照組比較，大鼠左心各段包括心尖段、室壁中間段及心基底段的FS%明顯下降（P＜0.05），LVEF亦明顯下降，而左心室收縮末期內(nèi)徑（LVESd）增加（P＜0.05），去除應(yīng)激因素后1周（第4周）各組大鼠再次心臟超聲檢查發(fā)現(xiàn)，TCC組實(shí)驗(yàn)大鼠心臟各段FS%、LVEF及LVESd趨于正常（表2）。

2.2 大鼠血清缺血修飾白蛋白（IMA）及心肌損傷標(biāo)志物水平檢測(cè)按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分別在第1、2、3周分別對(duì)各組大鼠血清中IMA表達(dá)水平及心肌損傷標(biāo)準(zhǔn)物CK、CK-MB及cTn-I水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示TTC組與空白組及對(duì)照組相比較心肌損傷標(biāo)準(zhǔn)物在實(shí)驗(yàn)第1～3周均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，而相反IMA表達(dá)水平在應(yīng)激后第1周時(shí)即出現(xiàn)了明顯升高情況（P＜0.05）且IMA表達(dá)水平隨應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)而進(jìn)一步出現(xiàn)表達(dá)升高（P＜0.05）（表3）。

2.3 心肌損傷組織學(xué)檢測(cè)在第3、4周分別處死各實(shí)驗(yàn)組半數(shù)大鼠（空白組及對(duì)照組15只大鼠，TTC組30只大鼠）獲取心肌組織并進(jìn)行切片及HE染色，結(jié)果顯示TTC組大鼠在第3周出現(xiàn)明顯心肌損傷，表現(xiàn)為心肌組織炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞水腫明顯、部分心肌組織出現(xiàn)局灶性出血及纖維化發(fā)生，損傷主要局限于心室的心尖部，很少達(dá)到心臟基部，而在第4周隨著應(yīng)激因素的解除，部分損傷心肌組織有所恢復(fù)（圖3）；通過(guò)顯微鏡下觀察并按照損傷程度進(jìn)行評(píng)分發(fā)現(xiàn)空白組及對(duì)照組比較，TCC組大鼠心肌損傷評(píng)分明顯增加（P＜0.05）（表4），而到第4周時(shí)隨著應(yīng)激因素的解除心肌損傷程度評(píng)分有所降低。

2.4 IMA表達(dá)水平與心肌損傷程度及心臟功能相關(guān)性分析通過(guò)對(duì)IMA表達(dá)水平與LVEF采用Pearson相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，IMA表達(dá)水平與LVEF兩者呈明顯負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.543，P=0.0103）（圖4A），LVEF越低則IMA表達(dá)水平越高；進(jìn)一步對(duì)IMA表達(dá)水平與心肌損傷程度評(píng)分進(jìn)行Pearson相關(guān)關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)IMA表達(dá)水平隨心肌損傷程度加重而表達(dá)水平增高，兩者呈正相關(guān)關(guān)系（r=0.443，P=0.0267）（圖4B）。

表2 各組大鼠左心各節(jié)段FS%、LVESd及LVEF比較（±s）

表2 各組大鼠左心各節(jié)段FS%、LVESd及LVEF比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

項(xiàng)目 空白組（n=30） 對(duì)照組（n=30） 應(yīng)激性心肌病組（n=60）第3周（n=15） 第4周（n=15） 第3周（n=15） 第4周（n=15） 第3周（n=30） 第4周（n=30）心尖段（FS） 43.65±2.64 43.11±2.55 47.62±3.15 47.31±3.77 7.31±0.31ab 46.81±2.98心中間段（FS） 28.82±3.81 28.99±3.53 30.77±4.92 30.29±4.26 14.11±1.82ab 31.47±4.36心基底段（FS） 21.91±2.33 20.73±2.68 23.67±3.99 23.27±4.23 53.72±2.73ab 20.58±3.42左心室收縮末期內(nèi)徑LVESd（mm） 5.98±0.34 6.15±0.46 6.31±0.59 6.61±0.98 8.41±0.75ab 6.52±0.62左室射血分?jǐn)?shù)LVEF 78.93±5.32 78.36±5.82 73.08±6.78 75.33±7.31 39.34±1.59ab 43.89±5.99

表3 各組大鼠血清中缺血修飾白蛋白及心肌損傷標(biāo)志物比較（±s）

表3 各組大鼠血清中缺血修飾白蛋白及心肌損傷標(biāo)志物比較（±s）

注：IMA：缺血修飾白蛋白；CK：肌酸激酶；CK-MB：肌酸激酶同工酶；cTn-I：肌鈣蛋白；與空白組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

項(xiàng)目 空白組（n=30） 對(duì)照組（n=30） 應(yīng)激性心肌病組（n=60）1周（n=30） 2周（n=30） 3周（n=15） 1周（n=30） 2周（n=30） 3周（n=15） 1周（n=30） 2周（n=30） 3周（n=30）IMA（ABSU） 0.41±0.091 0.409±0.054 0.411±0.092 0.419±0.098 0.413±0.085 0.421±0.071 0.751±0.098ab0.832±0.063ab0.934±0.055ab CK（U/L） 827.13±361.78 815.16±348.75 823.79±350.56 805.25±331.72 836.37±306.87 818.35±311.41 906.15±416.82 1032.85±458.38 2945.85±1765.38 CK-MB（U/L） 865.37±309.21 837.37±287.52 851.28±291.21 879.28±312.45 801.52±234.35 825.95±301.15 956.18±398.21 1039.89±413.25 1988.32±898.41 cTn-I（μg/L） 0.34±0.15 0.28±0.09 0.31±0.14 0.34±0.13 0.22±0.08 0.25±0.06 0.68±0.07 0.82±0.21 0.92±0.41

3 討論

TTC是1991年被Dote等發(fā)現(xiàn)在應(yīng)激狀態(tài)下誘發(fā)造成暫時(shí)性左心室功能不全一類(lèi)心臟疾病。近年來(lái)通過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該疾病發(fā)病率顯著增加且復(fù)發(fā)率高達(dá)10.9%[6]，常伴嚴(yán)重的心臟不良事件發(fā)生，因此深入研究TTC的發(fā)病機(jī)制對(duì)于減少該病的發(fā)生具有重要意義。

圖3 各組大鼠心肌組織病理切片比較

表4 各組大鼠心肌組織損傷積分情況（±s）

表4 各組大鼠心肌組織損傷積分情況（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與對(duì)照組比較，bP＜0.05

評(píng)分 空白組（n=30） 對(duì)照組（n=30） TTC組（n=60）第3周（n=15） 第4周（n=15） 第3周（n=15） 第4周（n=15） 第3周（n=30） 第4周（n=30）總分 1.00±0.23 1.03±0.31 1.01±0.12 1.03±0.11 9±0.46ab 4±0.32ab

缺血修飾白蛋白是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注發(fā)生時(shí)存在于血清中的一類(lèi)蛋白，常在心肌缺血早期即可被檢出[7]，以往的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)缺血修飾白蛋白與心肌梗塞、急性冠脈綜合征及腦梗塞均有相關(guān)[8-11]，但該蛋白在TTC中的報(bào)道尚不多見(jiàn)。

通過(guò)異丙腎上腺素持續(xù)注射誘導(dǎo)大鼠形成TTC模型，通過(guò)心臟彩超和心電圖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TTC組大鼠心臟左心室明顯膨出，并伴有心電圖ST段明顯抬高，且左心各段FS%及LVEF明顯下降、LVESd增大，去除應(yīng)激因素后以上指標(biāo)逐漸恢復(fù)正常，符合其病理生理演變過(guò)程。通過(guò)對(duì)各組大鼠血清中IMA及常規(guī)心肌損傷標(biāo)志物測(cè)定發(fā)現(xiàn)，IMA相對(duì)于常規(guī)心肌損傷標(biāo)志物在疾病早期（第1周）即出現(xiàn)了明顯的改變且隨應(yīng)激的時(shí)間延長(zhǎng)該蛋白表達(dá)進(jìn)一步增高。通過(guò)大鼠心肌組織切片觀察發(fā)現(xiàn)在TTC發(fā)生時(shí)，大鼠心肌組織明顯損傷。進(jìn)一步通過(guò)Pearson相關(guān)分析對(duì)大鼠心肌損傷程度與IMA表達(dá)水平分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈現(xiàn)明顯正相關(guān)關(guān)系，而通過(guò)LVEF與IMA表達(dá)水平相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示IMA表達(dá)水平與TTC心肌損傷及心臟功能改變明顯相關(guān)值得進(jìn)一步研究。

圖4 缺血修飾白蛋白與左室射血分?jǐn)?shù)及心肌損傷評(píng)分相關(guān)關(guān)系

綜上所述，缺血修飾白蛋白（IMA）在TTC中表達(dá)水平明顯升高，且與該疾病發(fā)生后心肌損傷程度及心功能變化明顯相關(guān)，有較高臨床早期診斷及病情評(píng)估價(jià)值。

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