黃芪百合顆粒對亞硝酸鈉中毒小鼠增強(qiáng)缺氧耐受力的作用及機(jī)制

張麗昕，蘇 韞，顏春魯，劉永琦,2，張苡銘，陳 剛，馮彩琴，成新平

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000；2. 敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730000)

亞硝酸鈉(NaNO2)是重要的工業(yè)原料，因其與食鹽類似而常常被誤食，引起中毒；它也是日常生活中常被使用的食品添加劑和動物飼料添加劑[1]，隔夜菜中也含有亞硝酸鈉，一般情況下，人體攝入0.3～0.5 g的亞硝酸鹽即可引起中毒。亞硝酸鈉中毒是因其使生物體內(nèi)血紅蛋白由二價(jià)鐵轉(zhuǎn)變?yōu)槿齼r(jià)生成高鐵血紅蛋白(MetHb)，破壞血紅蛋白攜氧能力，而造成組織細(xì)胞缺氧，且隨著亞硝酸鈉劑量的增加，MetHb含量增加，將導(dǎo)致組織缺氧直至死亡。三價(jià)鐵不但不能輸送氧，而且還阻礙同一血紅蛋白的二價(jià)鐵釋放氧，使氧合血紅蛋白解離曲線左移，進(jìn)一步阻礙氧的輸送和利用[2]，因此，亞硝酸鹽中毒嚴(yán)重?fù)p害心、腦、肺功能。中藥復(fù)方黃芪百合顆粒由黃芪、百合、紅景天等組成，具有益氣解毒、養(yǎng)陰潤肺、清心安神、增強(qiáng)免疫等功效，在中醫(yī)辨證論治上與亞硝酸鹽中毒是比較對癥的,且已有研究證實(shí)黃芪百合顆粒具有抗氧化損傷的作用[3]。故本研究通過觀察黃芪百合顆粒對亞硝酸鈉中毒小鼠存活時(shí)間、過氧化氫酶(CAT)活性和三磷酸腺苷(ATP)含量以及病理形態(tài)學(xué)的影響，進(jìn)一步探明黃芪百合顆粒對缺氧耐受力的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物、藥物、主要試劑與儀器SPF級昆明(KM)種雄性小鼠60只，鼠齡(6～8周齡)，體質(zhì)量(20±2)g，由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動物中心提供(動物質(zhì)量合格證號：62000600000206；許可證號：SCXK2015-0001)。

黃芪百合顆粒(由黃芪9 g，紅景天3 g，百合9 g，陳皮3 g，枸杞6 g，黃精9 g組成)；紅景天枸杞膠囊(青海鑫池源生物科技有限公司，批號：20160407)；亞硝酸鈉(天津市北辰方正試劑廠，批號：20160220)；40 g/L多聚甲醛(北京索萊科技有限公司，批號：20161024)。CAT試劑盒(批號：20161103)、ATP含量檢測試劑盒(批號：20161031)、蛋白定量測定試劑盒(批號：20161103)均購于南京建成生物工程研究所。

VIS-723N型分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司)，Thermo Scientific型微量加液槍(上海艾研生物科技有限公司)，XB-70型雪花制冰機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)、電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)，OLYMPUS BX53型正置光學(xué)顯微鏡。

1.2制備亞硝酸鈉中毒模型及實(shí)驗(yàn)分組小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，常規(guī)飲食，自由飲水。采用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠分為空白組、模型組、陽性對照組和黃芪百合顆粒低、中、高劑量組，每組10只。各組小鼠按相應(yīng)劑量每日灌胃給藥1次，連續(xù)給藥30 d。黃芪百合顆粒提取率為0.585，藥物的最終量為：39×0.585=22.815 g，按照人與小鼠的體質(zhì)量換算法：小鼠的等效劑量=22.815 g/60 kg×9.1≈3.5 g/(kg·d)，并分為低、中、高(1.75、3.5、7 g/kg)劑量，分別為臨床患者擬用劑量的0.5、1、2倍，臨用前用蒸餾水溶解(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心中藥藥理與毒物實(shí)驗(yàn)室)；陽性對照組給予紅景天枸杞膠囊液，人體每日推薦量為53.33 mg/kg，按照人與小鼠的體質(zhì)量換算為0.5 g/(kg·d)；空白對照組及模型組給予等體積的生理鹽水。

1.3亞硝酸鈉中毒缺氧實(shí)驗(yàn)?zāi)┐谓o藥1 h后，除空白對照組外，其余各組小鼠腹腔注射20 mg/mL亞硝酸鈉溶液(注射量為0.1 mL)后，放于250 mL廣口瓶中，立即用涂有白凡士林(保證其密閉性)的蓋子蓋緊瓶口，并開始計(jì)時(shí)，以呼吸停止為指標(biāo)，記錄小鼠的存活時(shí)間，并計(jì)算存活時(shí)間延長率=[(各藥物組存活時(shí)間-模型組存活時(shí)間)/模型組存活時(shí)間]×100%。

1.4臟器指數(shù)測定在小鼠腹腔注射亞硝酸鈉溶液前稱體質(zhì)量，待小鼠呼吸停止后，分離腦組織和心臟，用生理鹽水沖洗數(shù)遍后用濾紙吸干水分，稱重并計(jì)算心腦的臟器指數(shù)：小鼠心(腦)臟器指數(shù)=小鼠心(腦)組織質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

1.5腦、心、肺組織CAT活性檢測稱取腦、心、肺組織，用生理鹽水在冰水浴條件下制備成10%勻漿，2 500 r/min離心10 min，吸取上清并稀釋成最佳取樣濃度，測定CAT活性。具體步驟按照試劑盒說明書依次加入試劑后，在波長405 nm、光徑0.5 cm處測定各管的吸光度(A)值并計(jì)算：組織勻漿中CAT活力(U/mg prot)=(對照A值-測定A值)×271×(1/60×取樣量)/待測樣本蛋白質(zhì)量濃度(mg prot/mL)。

1.6磷鉬酸比色法檢測腦、心、肺組織ATP含量稱取腦、心、肺組織，按照試劑盒說明書測定ATP含量并計(jì)算：ATP(mmol/mg prot)=(測定A值-對照A值)/(標(biāo)準(zhǔn)A值-空白A值)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(1×103μmol/L)×樣本測定前稀釋倍數(shù)/待測樣本蛋白質(zhì)量濃度(mg prot/mL)。

1.7腦、心、肺組織病理觀察及病理評分取腦、心、肺組織經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定1周，HE染色，鏡下觀察病理形態(tài)學(xué)變化。各組分別觀察每只小鼠的組織HE染色切片，每張切片取5個(gè)高倍鏡視野并以損傷最嚴(yán)重的視野計(jì)分。

肺臟病理評分方法：觀察肺毛細(xì)血管擴(kuò)張、出血、肺間質(zhì)增寬、肺泡擴(kuò)張程度或斷裂。按照肺組織結(jié)構(gòu)損傷程度自輕至重分為5個(gè)等級：0分，肺血管、間質(zhì)、肺泡及支氣管正常；1分，間質(zhì)及肺泡出血范圍<25%，肺間質(zhì)輕度增寬；2分，間質(zhì)輕度增寬，肺泡腔出血范圍25%～50%，肺泡擴(kuò)張或斷裂；3分，間質(zhì)中度增寬，肺泡腔出血范圍50%～75%，肺泡明顯擴(kuò)張或斷裂，局部有肺萎縮；4分，間質(zhì)顯著增寬，肺泡腔出血范圍>75%，肺泡明顯擴(kuò)張或斷裂，肺間質(zhì)紅細(xì)胞滲出嚴(yán)重，肺泡壁受壓變窄。

心臟病理評分方法：觀察心肌細(xì)胞、心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張程度、心內(nèi)膜細(xì)胞水腫變性。按照心臟組織結(jié)構(gòu)損傷程度自輕至重分為5個(gè)等級：0分，心肌細(xì)胞大小、形態(tài)基本正常；1分，心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血較輕，心內(nèi)膜下細(xì)胞水腫輕微變性；2分，心肌細(xì)胞減少，心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血輕，心內(nèi)膜下細(xì)胞水腫變性；3分，心肌細(xì)胞變小，心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血較重，心內(nèi)膜下細(xì)胞水腫變性較重；4分，心肌細(xì)胞形態(tài)不正常，心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血嚴(yán)重，心內(nèi)膜下細(xì)胞水腫變性嚴(yán)重。

腦組織病理評分方法：觀察神經(jīng)細(xì)胞、腦組織形態(tài)、血管及周圍神經(jīng)間隙。按照腦組織結(jié)構(gòu)損傷程度自輕至重分為5個(gè)等級：0分，神經(jīng)元大小、形態(tài)、血管及周圍神經(jīng)間隙基本正常；1分，神經(jīng)元少量壞死，出現(xiàn)核周空泡現(xiàn)象；2分，腦神經(jīng)細(xì)胞壞死，組織疏松，血管及神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙輕度增寬；3分，神經(jīng)元大量壞死，組織疏松，血管及神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙中度增寬；4分，腦神經(jīng)細(xì)胞壞死嚴(yán)重，胞質(zhì)濃縮，核固縮，且出現(xiàn)核周空泡現(xiàn)象，組織疏松，血管及神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙顯著增寬。

2 結(jié) 果

2.1黃芪百合顆粒對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間的影響與空白組比較，模型組、陽性對照組、黃芪百合顆粒各劑量組小鼠存活時(shí)間明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，黃芪百合顆粒低、中劑量組存活時(shí)間顯著延長(P<0.01)，高劑量組小鼠存活時(shí)間雖有延長，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

表1 黃芪百合顆粒對小鼠亞硝酸鈉中毒存活時(shí)間的影響Tab.1 Effect of Radix Astragali Lilium Granules on the survival time of NaNO2 intoxication mice

2.2黃芪百合顆粒對亞硝酸鈉中毒小鼠腦、心臟指數(shù)的影響與空白組比較，模型組腦、心臟指數(shù)降低(P<0.05)；與模型組比較，陽性對照組、黃芪百合顆粒低、中、高劑量組腦、心臟指數(shù)均升高(P<0.05，P<0.01，表2)。

2.3黃芪百合顆粒對肺、心、腦組織CAT活性的影響與空白組比較，模型組小鼠肺、心、腦CAT活性明顯減弱(P<0.05，P<0.01)；與模型組對比，陽性對照組、黃芪百合顆粒低、中、高劑量組小鼠肺、心、腦組織CAT活性明顯升高(P<0.05，P<0.01，表3)。

2.4黃芪百合顆粒對肺、心、腦組織ATP含量的影響與空白組比較，模型組小鼠肺、心、腦組織ATP含量明顯下降(P<0.01)，與模型組比較，黃芪百合顆粒低、中高劑量組肺、心、腦組織ATP含量均升高(P<0.05，P<0.01，表4)。

表2 黃芪百合顆粒對亞硝酸鈉中毒小鼠心、腦臟器指數(shù)的影響Tab.2 Effect of Astragali Lilium Granules on the organ indexes of heart and brain of NaNO2 poisoned mice

表3 各組小鼠肺、心、腦組織中CAT活性變化Tab.3 Changes of CAT activity in lung, heart and brain tissues of mice U/mg prot)

表4 小鼠肺、心、腦組織ATP含量的變化Tab.4 Changes of ATP content in lung, heart and brain tissues of mice mmol/mg prot)

2.5黃芪百合顆粒對亞硝酸中毒小鼠肺、心、腦組織病理形態(tài)改變的影響空白組小鼠窒息而死，可見部分肺泡擴(kuò)張，但大部分組織正常，肺泡間質(zhì)無充血水腫，肺泡大小、形態(tài)基本正常，無明顯病理改變。與空白組相比，模型組肺泡組織擴(kuò)張、融合，間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔增厚或斷裂，肺泡壁狹窄；與模型組相比，陽性對照組出現(xiàn)肺泡組織擴(kuò)張、融合減輕，間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出減輕，有肺泡擴(kuò)張或斷裂，毛細(xì)血管擴(kuò)張、出血；黃芪百合顆粒低劑量組肺泡組織擴(kuò)張、融合減輕，間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出有所減輕，壁增厚、肺泡斷裂或擴(kuò)張、毛細(xì)血管擴(kuò)張出血減輕，肺泡壁狹窄逐漸變緩；中劑量肺泡肺泡組織擴(kuò)張、融合明顯減輕，肺泡斷裂或擴(kuò)張、毛細(xì)血管擴(kuò)張出血較輕，改善較為明顯；高劑量肺泡肺泡組織擴(kuò)張、融合明顯減輕，間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出明顯減輕，肺泡擴(kuò)張或斷裂，毛細(xì)血管擴(kuò)張、出血改善明顯肺泡壁狹窄變緩(圖1)。

空白組心肌細(xì)胞大小、形態(tài)基本正常，無明顯病理改變。與空白組比較，模型組心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血嚴(yán)重，心外膜下局部細(xì)胞水腫變性明顯。與模型組比較，陽性對照組小鼠心間質(zhì)充血較嚴(yán)重，心外膜下水腫變形較嚴(yán)重；黃芪百合顆粒低劑量組小鼠心間質(zhì)充血明顯減輕，心外膜下水腫變形變輕；中劑量組小鼠心間質(zhì)充血較輕，心外膜下水腫較輕；高劑量組小鼠心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血不明顯，心外膜下水腫較輕(圖2)。

空白組神經(jīng)元大小、形態(tài)基本正常，無明顯病理改變;與空白比較，模型組出現(xiàn)腦神經(jīng)細(xì)胞壞死，胞質(zhì)濃縮，核固縮，且出現(xiàn)核周空泡現(xiàn)象，組織疏松，血管及神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙增寬；與模型組比較，陽性對照組腦神經(jīng)細(xì)胞壞死減輕，組織疏松，血管及神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙增寬；黃芪百合顆粒低劑量組見腦神經(jīng)細(xì)胞少量壞死，出現(xiàn)核周空泡現(xiàn)象；中劑量組腦神經(jīng)細(xì)胞壞死程度有所減輕，核周空泡減少；而高劑量組小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞壞死程度明顯減輕，核周空泡減少(圖3)。

圖1 各組小鼠肺組織的病理變化(A-F)，HE×200及病理評分比較(G)Fig.1 Pathological changes (A-F) and pathological scores (G) of lung tissue

圖2 各組小鼠心組織的病理變化(A-F)，HE×200及病理評分比較(G)Fig.2 Pathological changes (A-F) and pathological scores (G) of heart tissue

圖3 腦組織的病理變化(A-F)，HE×200及病理評分比較(G)Fig.3 Pathological changes (A-F) and pathological scores (G) of brain tissue

3 討 論

亞硝酸鈉是一種劇毒的化學(xué)藥品，與血紅蛋白的結(jié)合能力很強(qiáng)，結(jié)合后使血紅蛋白中的二價(jià)鐵變成三價(jià)鐵從而形成MetHb或變性血紅蛋白，同時(shí)與羥基牢固結(jié)合而喪失攜氧能力,使剩余二價(jià)鐵離子與氧的親和力增高，導(dǎo)致氧離曲線左移，造成組織缺氧[4]。組織缺氧時(shí)，能量供應(yīng)不足，ATP生成受阻，代償性ADP分解加強(qiáng)，ADP分解成腺苷、次黃嘌呤、黃嘌呤等，后二者在黃嘌呤氧化酶作用下，在形成尿酸的過程中，產(chǎn)生超氧陰離子(O2)自由基，自由基大量生成,使防御系統(tǒng)CAT酶活力下降，不足以清除過量的自由基，從而引起脂質(zhì)過氧化瀑布狀的連鎖反應(yīng)和微循環(huán)障礙，導(dǎo)致組織中大量細(xì)胞受損[5]。并且CAT是體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的主要成分，能阻止H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)椤H，使之分解為H2O和O2。本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M小鼠注射了亞硝酸鈉后，表現(xiàn)出明顯的缺氧癥狀，呼吸短促，皮膚黏膜呈深咖啡色，ATP、CAT含量明顯下降，肺組織廣泛水腫，紅細(xì)胞滲出，肺泡間隔增厚或斷裂，肺泡壁狹窄，出現(xiàn)明顯肺氣腫，局部有肺萎縮；心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血嚴(yán)重，心外膜下局部細(xì)胞水腫變性；對腦部造成急性損傷[6]，促使腦神經(jīng)細(xì)胞壞死，胞質(zhì)濃縮，核固縮，且出現(xiàn)核周空泡現(xiàn)象，組織疏松，血管及神經(jīng)細(xì)胞周圍間隙增寬等一系列明顯的缺氧表現(xiàn)。

為了緩解亞硝酸鈉中毒所導(dǎo)致的缺氧和細(xì)胞損傷，本實(shí)驗(yàn)采用了中藥復(fù)方制劑黃芪百合顆粒為實(shí)驗(yàn)藥物(由黃芪9 g，紅景天3 g，百合9 g，陳皮3 g，枸杞6 g，黃精9 g組成)，黃芪是傳統(tǒng)補(bǔ)氣的中藥，具有補(bǔ)氣固表、益氣脫毒、斂瘡生肌、補(bǔ)中益氣的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪含有黃芪多糖、黃芪黃酮、黃芪皂苷等多種活性物質(zhì)，具有清除自由基、減少脂質(zhì)過氧化、抑制血小板聚集[7]、減輕腦水腫、延長缺氧小鼠存活時(shí)間等作用[8]。百合甘、微寒，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神、增強(qiáng)免疫等功效[9]。現(xiàn)代藥理研究表明，百合皂苷具有清除自由基的作用[10]，百合多糖具有抗氧化、抗纖維化等多方面的藥理作用[11]。紅景天主要生長在北極圈和高寒的山區(qū)，是一種傳統(tǒng)的藥用植物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其具有多方面的效能，如緩解體力疲勞、增強(qiáng)耐力、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤、抗炎和保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[12-13]，具有改善機(jī)體耐缺氧的能力[14]。陳皮味苦辛平無毒，理氣健脾、燥濕化痰等功效[15]。研究表明，陳皮黃酮類成分具有抗炎、抗氧化、抗癌、降血脂等藥理活性[16-18]，揮發(fā)油類成分主要有抗菌、抗炎等藥理作用[19-20]。上述諸藥都具有抗氧化損傷的作用。實(shí)驗(yàn)中給予低劑量的黃芪百合顆粒后，可見肺泡組織擴(kuò)張、融合減輕，肺間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出減輕，肺泡壁狹窄減緩、肺泡斷裂或擴(kuò)張、毛細(xì)血管擴(kuò)張出血減輕；小鼠心間質(zhì)充血明顯減輕，心外膜下水腫變形變輕；腦神經(jīng)細(xì)胞少量壞死，出現(xiàn)核周空泡；給予中劑量的黃芪百合顆粒后肺泡斷裂或擴(kuò)張、毛細(xì)血管擴(kuò)張出血較輕，改善較為明顯；小鼠心間質(zhì)充血較輕，心外膜下水腫較輕；腦神經(jīng)細(xì)胞壞死程度有所減輕，核周空泡減少；給予高劑量的黃芪百合顆粒后肺泡組織擴(kuò)張、融合明顯減輕，肺間質(zhì)內(nèi)紅細(xì)胞滲出減輕，肺泡壁狹窄減緩肺泡擴(kuò)張或斷裂，毛細(xì)血管擴(kuò)張減輕；小鼠心肌間質(zhì)血管擴(kuò)張充血不明顯，心外膜下水腫較輕；小鼠腦神經(jīng)細(xì)胞壞死程度明顯減輕，核周空泡減少。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不論是低、中劑量還是高劑量的黃芪百合顆粒，均延長了亞硝酸鈉中毒后小鼠的存活時(shí)間；黃芪百合顆粒各劑量組CAT 活性及ATP含量均有提高，對肺、心、腦組織缺氧現(xiàn)象均有不同程度減輕，表明黃芪百合顆粒能夠增加組織抗缺氧能力，不同程度地提高心、肺、腦組織對缺氧的耐受力，具有耐缺氧的作用。但其耐缺氧機(jī)制是否與紅景天相似，即通過減少超氧自由基的積累并增強(qiáng)機(jī)體自由基清除能力而發(fā)揮作用，尚需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上所述，在耐缺氧領(lǐng)域作為單味藥紅景天的替代品，黃芪百合顆粒可能具有一定的的研發(fā)價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。

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