變應(yīng)性鼻炎患者血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的變化及其相關(guān)性

張曉文，張慧云,2，王 維，湛萌萌，何韶衡

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，變態(tài)反應(yīng)與臨床免疫研究中心，遼寧錦州 121001；2. 蘇州市相城人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇蘇州 215100)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis, AR)是由過(guò)敏原引起的鼻部炎癥性疾病[1]，主要癥狀是鼻塞、鼻腔分泌物增多、鼻腔瘙癢。目前認(rèn)為遺傳和環(huán)境如過(guò)敏原均參與AR發(fā)病[2]。Toll樣受體(Toll-like receptor, TLR)是表達(dá)于不同細(xì)胞的模式識(shí)別受體家族，在過(guò)敏性疾病中起重要作用[3]。病原微生物及其產(chǎn)物和內(nèi)源性刺激均可通過(guò)TLR依賴(lài)途徑激活靶細(xì)胞，引起或加重過(guò)敏反應(yīng)[4]。

TLR2在識(shí)別革蘭氏陰性細(xì)菌中起重要作用，最近的研究發(fā)現(xiàn)過(guò)敏患者TLR2 mRNA水平升高[5]，提示TLR2可能參與過(guò)敏反應(yīng)。TLR4可識(shí)別脂多糖(LPS)，TLR4激活后可產(chǎn)生針對(duì)入侵病原微生物免疫應(yīng)答。研究報(bào)道，過(guò)敏性哮喘和AR患者TLR4表達(dá)升高[6]，提示TLR4可能參與氣道炎癥性疾病。呼吸道的炎癥細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞均表達(dá)TLR7。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)證明TLR7激動(dòng)劑可控制過(guò)敏性哮喘[7]，TLR9大量表達(dá)于AR患者鼻黏膜上皮細(xì)胞和骨髓白細(xì)胞[8]，提示TLR7和TLR9可能參與過(guò)敏性氣道炎癥。

嗜酸性粒細(xì)胞參與AR等氣道過(guò)敏性疾病[9]。然而，目前人們對(duì)AR患者血液嗜酸性粒細(xì)胞TLRs的表達(dá)，尤其是過(guò)敏原對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞上TLRs表達(dá)的影響還知之甚少。本研究旨在用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測(cè)TLR2、TLR4、TLR7和TLR9在AR患者嗜酸性粒細(xì)胞群中的表達(dá)情況，并分析其相關(guān)性，以期為AR的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)試劑購(gòu)自Biolegend(San Diego, CA, USA)的試劑：APC/Cy7耦合的小鼠抗人CCR3、APC耦合的鼠抗人TLR4、APC耦合的小鼠IgG1、BV421耦合的小鼠IgG1、Zombie Aqua Fixable Viability kit(死細(xì)胞去除染料)、FcR阻斷劑、紅細(xì)胞裂解液；購(gòu)自R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)的試劑：PE耦合的小鼠抗人TLR7、PE耦合的小鼠IgG2A；購(gòu)自Santa Cruz(Delaware Ave Santa Cruz, CA, USA)的試劑：FITC耦合小鼠抗人TLR9、FITC耦合的小鼠 IgG2A；購(gòu)自BD Biosciences Pharmigen(Beldford, MA, USA)公司的試劑：BV421耦合的小鼠抗人TLR2。蒿草花粉過(guò)敏原提取液、塵螨提取液和梧桐花粉過(guò)敏原提取液購(gòu)自北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限責(zé)任公司(中國(guó))；PBS緩沖液購(gòu)自Solarbio(北京，中國(guó))；Cytofix/CytopermTM固定/透膜試劑盒購(gòu)自BD Biosciences Pharmigen(Beldford, MA, USA)；皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)過(guò)敏原購(gòu)自ALK-ABELLO(Denmark)；其他常用的化學(xué)試劑如鹽和緩沖液均為分析級(jí)純度。低溫高速離心機(jī)(Thermo Scientific, USA)，水浴鍋(精宏，中國(guó))，F(xiàn)ACSVerse流式細(xì)胞儀(BD Biosciences, USA)。

1.2研究對(duì)象共募集了40位志愿者，其中24例AR患者(AR病例組)和16例健康人(正常對(duì)照組)，其一般資料見(jiàn)表1，組間在年齡、性別構(gòu)成上差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)AR的診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2015年美國(guó)耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)會(huì)專(zhuān)家組發(fā)布的AR臨床實(shí)踐指南[10]；所有AR患者均處于急性發(fā)作期，且至少2周前停止服用抗鼻炎治療的藥物，所有志愿者至少1月內(nèi)未發(fā)生過(guò)呼吸道感染。本臨床研究獲得了錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并與每位志愿者均簽訂了知情同意書(shū)。

表1 志愿者的一般資料Tab.1 General information of the volunteers

1.3血液樣本的采集對(duì)募集的AR急性發(fā)作期入院患者和門(mén)診正常人的志愿者分別采集病史資料；均進(jìn)行皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)，點(diǎn)刺試驗(yàn)陽(yáng)性的AR患者和點(diǎn)刺試驗(yàn)陰性的正常人為本研究的研究對(duì)象，即AR病例組和正常對(duì)照組。每位志愿者均采集1 mL外周靜脈血于含EDTA抗凝劑的采血管中。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的表達(dá)全血在無(wú)菌環(huán)境下分別加入塵螨、蒿草花粉和梧桐花粉過(guò)敏原提取液(質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL)，37 ℃水浴震蕩孵育1 h；1 200 r/min 離心6 min后棄去上清，加入死細(xì)胞去除染料和FcR阻斷劑，均勻混合后，避光孵育15 min，然后加入抗CCR3、TLR2和TLR4抗體，避光孵育15 min后加入紅細(xì)胞裂解液，避光孵育12 min，離心棄上清后加入1 mL的PBS，1 200 r/min離心6 min，棄上清，用固定/透膜液固定細(xì)胞，透膜洗液清洗后加入抗TLR7和TLR9抗體孵育，再用PBS清洗，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 13.0軟件分析數(shù)據(jù)，多組間比較采用秩和檢驗(yàn)，組間差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)用Mann-WhitneyU進(jìn)一步做比較。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1蒿草花粉過(guò)敏原誘導(dǎo)AR嗜酸性粒細(xì)胞富集群TLR2+細(xì)胞比例升高流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)嗜酸性粒細(xì)胞富集群(設(shè)門(mén)方法見(jiàn)圖1)中TLR2的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，AR患者血液經(jīng)蒿草花粉刺激后，嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR2+細(xì)胞的比例升高了約7%(P<0.05)，梧桐花粉和塵螨過(guò)敏原提取液對(duì)TLR2的表達(dá)影響差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。3種過(guò)敏原對(duì)正常對(duì)照組TLR2表達(dá)影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對(duì)AR病例組患者靜息狀態(tài)下嗜酸性粒細(xì)胞富集群TLR2+細(xì)胞比例與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 嗜酸性粒細(xì)胞富集群的設(shè)門(mén)方法Fig.1 Gating strategies for eosinophil-enriched cells

2.2AR患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR4表達(dá)增強(qiáng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AR患者組和正常對(duì)照組外周血的嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR4(圖3A、B)的表達(dá)，結(jié)果顯示，AR患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR4+細(xì)胞的MFI與健康對(duì)照組相比升高20%(P<0.05)。梧桐花粉、蒿草花粉和塵螨過(guò)敏原提取液對(duì)健康人和AR患者血液嗜酸性粒細(xì)胞TLR4表達(dá)影響很小(P>0.05)。

圖3 人外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR4細(xì)胞MFI的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(A)及表達(dá)變化分析(B)Fig.3 Representative flow cytometric graphs (A) of MFI of TLR4 in eosinophil-enriched cells from human blood and expressions by MFI analysis (B)

2.3AR患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR7+細(xì)胞比例增多用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)AR患者和正常人群血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群TLR7+和TLR9+的細(xì)胞比例，結(jié)果顯示，與健康人相比，AR患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR7+細(xì)胞的比例升高4.8倍(圖4A、B)，TLR7+嗜酸性粒細(xì)胞的MFI升高46%(圖4C、D，P<0.05)；而TLR9在正常人和AR患者血液嗜酸性粒細(xì)胞的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 人外周血嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR7+細(xì)胞表達(dá)的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果(A)和百分比分析(B)、MFI代表圖(C)及表達(dá)變化的比較(D)Fig.4 Representative flow cytometric graphs (A) of TLR7+ expression in eosinophil-enriched cells from human blood and percentage analysis (B), MFI of TLR7 (C) and MFI analysis of the expression (D)

2.4嗜酸性粒細(xì)胞群TLR2+和TLR4+、TLR2+和TLR7+、TLR7+和TLR9+的表達(dá)中度相關(guān)靜息狀態(tài)下，AR患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR2和TLR7表達(dá)增強(qiáng)，蒿草花粉過(guò)敏原誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞富集群TLR2表達(dá)升高，提示TLR2、TLR4、TLR7和TLR9之間有潛在關(guān)系。進(jìn)一步對(duì)其細(xì)胞表達(dá)水平進(jìn)行了相關(guān)性分析，Pearson檢驗(yàn)結(jié)果顯示(表2)，AR患者嗜酸性粒細(xì)胞群中TLR2+和TLR4+、TLR2+和TLR7+、TLR7+和TLR9+的嗜酸性粒細(xì)胞均呈中度相關(guān)(Pearson相關(guān)系數(shù)分別為r=-0.670，P<0.01；r=-0.430，P<0.05；r=0.446，P<0.05)。

表2 AR患者TLR2+、TLR4+、TLR7+和TLR9+嗜酸性粒細(xì)胞的相關(guān)性Tab.2 Correlations between TLR2+, TLR4+ ,TLR7+ and TLR9+ eosinophils

3 討 論

螨蟲(chóng)和植物花粉如艾蒿花粉、梧桐花粉是室內(nèi)、外過(guò)敏原的重要來(lái)源，通過(guò)與過(guò)敏反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞如嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞表面的IgE-FcεRI復(fù)合物發(fā)生反應(yīng)可誘導(dǎo)AR等過(guò)敏性疾病的發(fā)生[11-12]。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)參與各種抗原免疫應(yīng)答的TLR也可誘導(dǎo)AR發(fā)病[13-14]。

TLR2配體可以抑制肥大細(xì)胞脫顆粒[15]，提示TLR2可能有抑制過(guò)敏反應(yīng)的作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)AR患者靜息狀態(tài)下嗜酸性粒細(xì)胞富集群TLR2+細(xì)胞的比例降低，提示進(jìn)一步證實(shí)TLR2可抑制AR發(fā)?。欢?jīng)蒿草花粉過(guò)敏原刺激后，AR患者血液嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR2升高約7%，提示過(guò)敏原中的某種蛋白成分可能誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)TLR2，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)TLR4在AR患者中表達(dá)水平升高[6]，提示TLR4可能參與AR。本研究發(fā)現(xiàn)AR患者嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR4+細(xì)胞的MFI升高20%(P<0.05)，進(jìn)一步提示TLR4參與AR發(fā)病。

有報(bào)道稱(chēng)TLR7激活嗜酸性粒細(xì)胞與患者的過(guò)敏狀態(tài)有關(guān)[16]。此外，研究發(fā)現(xiàn)TLR7廣泛參與氣道過(guò)敏性疾病[7,16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，AR患者靜息狀態(tài)下嗜酸性粒細(xì)胞富集群中TLR7+細(xì)胞的比例升高4.8倍。由于TLR7激動(dòng)劑可控制過(guò)敏性哮喘[7]，本研究結(jié)果提示AR可能通過(guò)反饋機(jī)制誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)TLR7，AR發(fā)病可能與其他細(xì)胞TLR7表達(dá)減少有關(guān)。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)AR患者和健康人血液嗜酸性粒細(xì)胞TLR9的差異性表達(dá)，但并不排除其他細(xì)胞通過(guò)TLR9影響過(guò)敏性炎癥發(fā)生的可能。

TLRs通過(guò)與其配體相互作用，激活免疫細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞而發(fā)揮天然免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。TLRs(TLR3除外)與其配體交聯(lián)可誘導(dǎo)MyD88募集至TLRs上的TIR結(jié)構(gòu)域[19-20]，提示TLRs之間可能存在某種聯(lián)系。本研究發(fā)現(xiàn)AR患者嗜酸性粒細(xì)胞群中TLR2+和TLR4+、TLR2+和TLR7+、TLR7+和TLR9+的嗜酸性粒細(xì)胞均呈中度相關(guān)，提示TLRs可能通過(guò)誘導(dǎo)其他TLRs的表達(dá)而參與AR?？傊?，嗜酸性粒細(xì)胞源的TLR2、TLR4和TLR7可能在AR中起重要作用，TLR2、TLR4和TLR7可能是治療AR的潛在靶點(diǎn)。

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