血必凈注射液對急性百草枯中毒大鼠肺組織中炎性因子表達(dá)影響研究

趙艷霞，付 贇，王 鑫

(河北省邯鄲市中心醫(yī)院，河北 邯鄲 056001)

百草枯(PQ)合成于上世紀(jì)50年代，是聯(lián)吡啶類非接觸型除草劑，其打到草上很快起效，但是遇到土壤就鈍化、立刻失效，對植物的根部沒有傷害，也不會(huì)在土壤中殘留，對環(huán)境幾乎沒有影響，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用[1]。但是百草枯中毒事件近年來頻有發(fā)生，其大量口服可引起急性中毒，患者常常在24 h內(nèi)出現(xiàn)急性肺水腫、動(dòng)脈血氧分壓降低、肝衰竭、腎衰竭等多臟器功能障礙，病死率極高；而小量口服者早期癥狀不明顯，或有輕度胸悶，往往因忽視其嚴(yán)重性而錯(cuò)過最佳治療時(shí)機(jī)。由于百草枯排泄緩慢，在肺和肌肉內(nèi)蓄積，作用持久，肺部逐漸出現(xiàn)炎性滲出，一部分患者發(fā)展為進(jìn)行性呼吸困難、呼吸衰竭而死亡，即使存活的患者也會(huì)最終出現(xiàn)肺纖維化，影響生活質(zhì)量。目前百草枯中毒后出現(xiàn)肺損傷的機(jī)制尚未完全闡明，也無特效治療藥物[2]。近年來血必凈注射液嘗試用于百草枯中毒的治療，有一定效果，但作用機(jī)制不明。本研究觀察了血必凈注射液對百草枯中毒大鼠肺組織中氧自由基超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)含量及細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達(dá)的影響，旨在探討血必凈注射液治療百草枯中毒的機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1動(dòng)物 健康成年Wistar大鼠108只，雌雄不拘，體質(zhì)量220～270 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號：SCXK(冀)2015-0003。為適應(yīng)環(huán)境，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)，飼養(yǎng)于無菌動(dòng)物室內(nèi)，保持溫度21～24 ℃、濕度40%～50%，自由飲水分籠喂養(yǎng)，墊料、飲用水、飼料每天更換。1周后，精神、飲食活動(dòng)正常的動(dòng)物納入實(shí)驗(yàn)。

1.2材料及試劑 20%百草枯原液，山東大成農(nóng)藥股份有限公司生產(chǎn)；血必凈注射液，天津紅日藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20040033。MDA檢測試劑盒及SOD檢測試劑盒均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。兔抗鼠IL-6、TGF-β1多克隆抗體、DAB顯色試劑盒、SABC二抗試劑盒由福州邁新生物制品有限公司生產(chǎn)。電熱恒溫水浴箱、臺(tái)式低速離心機(jī)(0412-1)、大鼠代謝籠、DHP-9082型恒溫干燥箱均由上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，日本OLYPUS公司BX51光學(xué)顯微鏡和-80 ℃冰箱購自日本Sanyo株式會(huì)社。德國EG1150H組織包埋機(jī)由LEICA公司生產(chǎn)。

1.3動(dòng)物分組及模型制備 將108只Wistar大鼠隨機(jī)分成對照組、染毒組、干預(yù)組，每組36只。20%百草枯原液用生理鹽水溶解，染毒組及干預(yù)組按25 mg/kg劑量一次性腹腔注射，對照組給予等體積生理鹽水腹腔注射。然后干預(yù)組給予血必凈注射液4 mL/kg腹腔注射,對照組及染毒組給予等量生理鹽水腹腔注射，均每天1次。

1.4取材 每組分別在干預(yù)后1，3，7，14，21，28 d各取6只大鼠，取標(biāo)本前禁食水4 h，使用乙醚進(jìn)行麻醉，剃光胸部皮膚，乙醇消毒，使用干燒滅菌的組織剪逐層開胸，在左、右支氣管處分離，取出肺組織，從肺尖部切取標(biāo)本，剪掉周圍的包膜及結(jié)締組織，用冰鹽水清洗血漬，濾紙擦干。標(biāo)本一部分制備勻漿，一部分制備切片。

1.5SOD活力及MDA含量測定 取肺組織標(biāo)本稱質(zhì)量，量取9倍于組織塊質(zhì)量的冰鹽水，與組織標(biāo)本一起倒入玻璃勻漿器中，制備10%的組織勻漿，然后以3 000～4 000 r/min速度離心30 min，取上清液，采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活力，采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測MDA含量。

1.6HE染色光鏡檢查及IL-6、TGF-β1表達(dá)檢測 將肺組織標(biāo)本放入10%中性甲醛固定，石蠟包埋、切片，厚約5 μm，應(yīng)用PBS液(pH 7.14)二甲苯脫蠟3次(3 min/次)，溶度乙醇(100%→95%→80%→70%)進(jìn)行水化，切片蒸餾水沖洗后，放入3% H2O2溶液室溫孵育30 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶。隨后PBS液沖洗3次(5 min/次)，在沸騰的0.01 mol/L枸櫞酸緩沖液中放入切片以修復(fù)抗原，為減少非正常染色，用10%正常山羊免疫血清封閉游離結(jié)合位點(diǎn)，室溫放置10 min，滴加一抗工作液(1∶100稀釋)，兔抗鼠IL-6、TGF-β1多克隆抗體，在4 ℃的冰箱內(nèi)孵育過夜。之后，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。PBS緩沖液沖洗3次(5 min/次)；滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液，孵育30 min，切片應(yīng)用PBS液洗刷(5 min×3次)；之后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉素-卵白素工作液，常溫下孵育30 min，PBS液沖洗(5 min×3次)；顯色劑DAB加入切片中，在顯微鏡監(jiān)視下顯色2～3 min,顯色滿意后蒸餾水沖洗切片，終止顯色。鹽酸乙醇分化，蘇木精復(fù)染5 min，伊紅染色，蒸餾水沖洗返藍(lán)，依次應(yīng)用梯度乙醇脫水，中性樹膠封固，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明。每組任意取5張切片，400倍光學(xué)顯微鏡拍照、觀察、保存，每張切片上隨機(jī)的、相互不重疊10個(gè)高倍視野作為觀察對象。以細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，在胞漿和/或胞核中出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒狀免疫復(fù)合物為陽性細(xì)胞。Image-Pro Plus(IPP)6.0免疫組化圖像軟件計(jì)算IL-6、TGF-β1的平均吸光值，同時(shí)檢測背景值，前者減去后者作為該標(biāo)本的最后結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠肺組織病理表現(xiàn) 對照組肺表面包膜光滑有彈性，質(zhì)軟呈淡紅色，無淤點(diǎn)及水腫；光鏡下可見肺泡壁薄，結(jié)構(gòu)完整、清晰，排列整齊，肺泡腔內(nèi)未見滲出，肺間質(zhì)無增寬及充血，有少許纖維組織。染毒組肺表面呈暗紅色，體積顯著膨脹，水腫明顯，包膜張力高，表面大片淤斑，在肺邊緣外側(cè)有散在的出血點(diǎn)，肺切面有淤血滲出；光鏡下可見肺泡壁充血腫脹，結(jié)構(gòu)塌陷，部分肺泡架構(gòu)破壞，肺泡腔內(nèi)有纖維素及紅細(xì)胞聚集，形成粉紅色滲出液，其周圍組織出血明顯，肺間質(zhì)增厚，氣管周圍大量炎細(xì)胞浸潤，血管水腫，主要為淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞；染毒7 d時(shí)肺泡及肺間質(zhì)水腫達(dá)到頂峰，伴散在的肺出血，有多個(gè)肺泡形成炎癥，表面有透明膜，見圖1；染毒21 d時(shí)肺間質(zhì)內(nèi)炎癥較前減輕，有大量成纖維細(xì)胞增生；染毒28 d時(shí)肺泡膈相互融合，肺間質(zhì)膠原纖維增厚。干預(yù)組肺泡及肺間質(zhì)病變有不同程度改善，病理學(xué)改變介于染毒組與對照組之間，見圖2。

圖1 染毒組染毒7 d光鏡下肺組織病理表現(xiàn)(HE，×400)

圖2 干預(yù)組干預(yù)7 d光鏡下肺組織病理表現(xiàn)(HE，×400)

2.2各組大鼠肺組織中SOD活力及MDA含量染毒后，染毒組大鼠肺組織中SOD活力顯著降低，此后逐漸上升，但各時(shí)間點(diǎn)均明顯低于對照組(P均<0.05)；干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)SOD活力均明顯高于染毒組(P<0.05)，但染毒1～14 d仍明顯低于對照組(P均<0.05)，染毒21 d、28 d與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。染毒后，染毒組大鼠肺組織中MDA含量迅速升高，3 d達(dá)到最高峰，以后呈逐漸下降趨勢，但各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于對照組(P均<0.05)；干預(yù)組染毒1～21 d MDA含量均明顯低于染毒組(P均<0.05)，但染毒1～14 d仍明顯高于對照組(P均<0.05)，染毒21 d、28 d與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

2.3各組大鼠肺組織IL-6、TGF-β1表達(dá)免疫組化染色表現(xiàn) 對照組肺組織中IL-6、TGF-β1表達(dá)很少，干預(yù)3 d時(shí)染色表現(xiàn)見圖3及圖4；染毒組肺組織中IL-6、TGF-β1大量表達(dá)，染毒3 d時(shí)達(dá)到最高峰，見圖5及圖6；干預(yù)組肺組織中IL-6、TGF-β1表達(dá)情況介于對照組和染毒組，干預(yù)3 d時(shí)染色表現(xiàn)見圖7及圖8。

2.4各組大鼠肺組織中IL-6、TGF-β1表達(dá)情況染毒組各時(shí)間點(diǎn)肺組織中IL-6、TGF-β1表達(dá)量均明顯高于對照組(P均<0.05)。干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)肺組織中IL-6、TGF-β1表達(dá)量均明顯低于染毒組(P均<0.05)，但仍明顯高于對照組(P均<0.05)。見表2。

3 討 論

表1 各組大鼠肺組織中SOD活力及MDA含量比較

注：①與對照組比較，P<0.05；②與染毒組比較，P<0.05。

圖3 對照組干預(yù)3 d時(shí)IL-6表達(dá)情況(×400)

圖4 對照組干預(yù)3 d時(shí)TGF-β1表達(dá)情況(×400)

圖5 染毒組染毒3 d時(shí)IL-6表達(dá)情況(×400)

圖6 染毒組染毒3 d時(shí)TGF-β1表達(dá)情況(×400)

圖7 干預(yù)組干預(yù)3 d時(shí)IL-6表達(dá)情況(×400)

圖8 干預(yù)組干預(yù)3 d時(shí)TGF-β1表達(dá)情況(×400)

指標(biāo)組別1d3d7d14d21d28d對照組8.64±0.957.36±0.766.82±0.797.07±0.957.55±0.817.49±0.72IL-6染毒組39.15±2.50①41.18±3.39①38.08±3.40①36.00±3.37①25.51±2.60①20.29±2.28①干預(yù)組29.25±2.98①②32.95±3.22①②27.86±3.19①②22.15±2.45①②19.35±2.06①②15.39±1.75①②對照組8.41±1.148.40±1.037.60±0.988.27±1.107.53±1.158.17±1.06TGF-β1染毒組45.80±2.57①51.58±2.86①45.51±2.51①37.19±1.61①31.17±1.45①25.15±1.33①干預(yù)組38.76±1.66①②41.14±1.80①②36.98±1.84①②29.51±1.66①②22.38±1.41①②17.21±1.37①②

注：①與對照組比較，P<0.05；②與染毒組比較，P<0.05。

目前研究證明，在哺乳類動(dòng)物的肺泡上皮細(xì)胞中存在多胺類物質(zhì)攝取系統(tǒng)，多胺類物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)和百草枯攝取存在競爭性抑制，百草枯進(jìn)入體內(nèi)后，被肺上皮細(xì)胞主動(dòng)攝取并轉(zhuǎn)運(yùn)，在肺組織內(nèi)大量蓄積；同時(shí)由于百草枯在體內(nèi)代謝緩慢，因此肺成了中毒早期被重點(diǎn)攻擊的靶器官[3]。百草枯中毒誘導(dǎo)的肺損傷一般經(jīng)過肺組織炎癥、間質(zhì)增生及肺纖維化等階段，早期為炎性滲出期，在肺泡及肺間質(zhì)內(nèi)有大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤，釋放炎性因子，導(dǎo)致肺泡上皮細(xì)胞的彌漫性水腫及壞死、脫落，之后逐漸進(jìn)入纖維增生期，肺泡塌陷，成纖維細(xì)胞增生，間質(zhì)增厚，纖維化形成[4]。本實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，染毒組大鼠肺臟體積明顯變大，腫脹明顯，呈暗紅色，表面散在出血點(diǎn)；光鏡下可見氣管及血管周圍炎性細(xì)胞浸潤、水腫，肺泡壁結(jié)構(gòu)塌陷，肺泡腔內(nèi)有水腫液及纖維素滲出，肺間質(zhì)增厚。以上病理變化均提示百草枯可導(dǎo)致肺損傷，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。但肺損傷確切的發(fā)病機(jī)制還不十分清楚，目前認(rèn)為氧自由基、鈣超載、缺血/再灌注損傷及毒物本身等在器官損傷中起關(guān)鍵作用，其中氧自由基導(dǎo)致的細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引人關(guān)注[5]?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)，百草枯進(jìn)入細(xì)胞后，其分子作為電子受體，在NADPHⅡ作用下轉(zhuǎn)化為PQ+，再經(jīng)單電子傳遞而還原，之后與分子氧作用形成超氧陰離子(O2-)及聯(lián)吡啶陽離子，百草枯分子通過一系列反應(yīng)，高活性氧自由基激增，從而引起細(xì)胞氧化損傷、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)以及機(jī)體內(nèi)大量炎癥因子的釋放[6]。但是高活性的氧自由基不容易測定，因此本實(shí)驗(yàn)選擇SOD、MDA作為觀察指標(biāo)。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的自由基清除酶，能夠催化超氧化物進(jìn)行歧化反應(yīng)生成氧氣和過氧化氫，其作用底物是超氧陰離子自由基， SOD通過調(diào)節(jié)、清除O2-、OH-等活性氧自由基，抑制過氧化反應(yīng)，使過氧化物分解為無毒的醇。當(dāng)氧自由基增多時(shí)，SOD被消耗，含量減少，機(jī)體清除自由基、抗脂質(zhì)過氧化損傷的能力下降。MDA是細(xì)胞內(nèi)多聚不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生的終末代謝產(chǎn)物，檢測其含量可間接反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷的程度。本研究結(jié)果顯示，肺組織中SOD活力在染毒后即刻下降，在以后時(shí)間段里雖有恢復(fù)，但仍低于對照組，提示百草枯進(jìn)入細(xì)胞后產(chǎn)生大量有活性的自由基，機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，消耗了細(xì)胞內(nèi)的自由基清除酶；與此同時(shí)，染毒大鼠肺組織中MDA含量顯著升高，說明細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷程度嚴(yán)重。上述結(jié)果提示百草枯導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強(qiáng)，誘發(fā)肺損傷。

百草枯中毒的分子細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)炎性因子的產(chǎn)生和釋放可能是百草枯中毒導(dǎo)致肺損傷的重要原因[7-8]。IL-6由肺泡巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞以及T/B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，它可以調(diào)節(jié)應(yīng)激及免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞分化成熟及免疫球蛋白的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)單核/巨筮細(xì)胞功能，形成免疫復(fù)合物；它能激活多個(gè)傳導(dǎo)通路，如Ras/ERK、JAK/STAT、PI3-K/Akt等，在宿主的炎癥調(diào)控和防御系統(tǒng)中起至關(guān)重要的作用[9]。Xu等[10]和李闖等[11]研究均證實(shí)百草枯中毒后IL-6含量即刻升高，于 3～6 d達(dá)到較高水平，提示IL-6是百草枯中毒后早期釋放的促炎因子，在百草枯導(dǎo)致的肺損傷中起至關(guān)重要的作用，它的升高預(yù)示組織損傷程度加重。TGF-β1可促進(jìn)巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞分裂趨化，促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)積聚，使膠原沉積增加；另外TGF-β1早期可促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肺水腫加重，晚期可導(dǎo)致肺纖維化，在肺損傷中扮演重要角色[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染毒第1天，染毒大鼠肺組織中IL-6和TGF-β1即明顯升高，第3天達(dá)到高峰，此后雖有下降，但仍維持在高水平，推測它們可能參與了肺組織的損傷過程，二者不僅是百草枯中毒早期釋放的促炎因子，而且還是中晚期導(dǎo)致肺纖維化的關(guān)鍵因素，在百草枯誘導(dǎo)的肺損傷中發(fā)揮了重要作用。

目前，對百草枯中毒無特效解毒藥物，許多治療方法仍處于探索階段。血必凈注射液為國家二類新藥，具有疏通經(jīng)絡(luò)、活血化瘀的功能，主要由川芎、當(dāng)歸、紅花、魚腥草、丹參、赤芍等組成，其有效成分為丹參素、原兒茶醛、川芎嗪、阿魏酸、紅花黃色素，它們具有增加組織耐缺氧能力，清除氧自由基，提高自由基清除酶系的活性，降低毛細(xì)血管通透性，減少滲出，改善局部血液循環(huán)，降低內(nèi)毒素水平，對抗單核/巨噬細(xì)胞系統(tǒng)釋放內(nèi)源性炎性遞質(zhì)，調(diào)節(jié)免疫功能作用[13]。趙薇等[14]研究表明，血必凈注射液可保護(hù)SIRS及MODS等危重癥患者的臟器功能，提高救治率。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干預(yù)組大鼠肺泡腔內(nèi)的滲出、毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血以及炎性細(xì)胞浸潤等病理改變顯著好轉(zhuǎn)，說明血必凈注射液可抑制病情發(fā)展，阻止百草枯對肺的損傷；大鼠肺組織中SOD活性明顯高于染毒組，而MDA含量明顯低于染毒組，提示血必凈注射液具有顯著抗氧化作用；大鼠肺組織中IL-6和TGF-β1蛋白表達(dá)量明顯低于染毒組，說明血必凈注射液可抑制百草枯導(dǎo)致炎癥因子的過度產(chǎn)生和釋放。

綜上所述，氧自由基和細(xì)胞因子IL-6、TGF-β1均參與了百草枯所致肺損傷，而血必凈注射液能夠通過調(diào)節(jié)這些指標(biāo)表達(dá)而減輕染毒大鼠肺組織損傷，為百草枯中毒的治療提供了一個(gè)新途徑。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 中國醫(yī)師協(xié)會(huì)急診醫(yī)師分會(huì). 急性百草枯中毒診治專家共識(2013)[J]. 中國急救醫(yī)學(xué),2013,33(6):484-489

[2] 黃偉. 百草枯急性中毒機(jī)制及其治療研究進(jìn)展[J]. 臨床合理用藥雜志,2016,9 (36):188-190

[3] 董建光，邱澤武. 百草枯中毒致肺纖維化的治療現(xiàn)狀[J]. 中國醫(yī)刊,2017,52(2):23-26

[4] 李書文，沈彥萍. 急性百草枯中毒發(fā)病機(jī)制與治療研究進(jìn)展[J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘,2015,15(97):49-50

[5] 孫百勝，何躍忠. 百草枯中毒機(jī)制及臨床治療進(jìn)展[J]. 中華危重病急救醫(yī)學(xué),2017,29(11):1043-1046

[6] 廖泳，吳曉飛，王芳莉，等. 百草枯中毒急性肺損傷的作用機(jī)制及丙酮酸乙酯干預(yù)研究[J]. 安徽醫(yī)藥,2017,21(4):630-634

[7] Jiang YS,Ma YY,Wang ZQ,et al. Therapeutic effects of smeeta or smectite powder on rats with paraquat toxieation[J]. World J Emerg Med,2013,4(2):144-150

[8] 陳壽權(quán)，冷巧云，何愛文，等. 急性百草枯中毒大鼠肺泡灌洗液及血清炎性因子變化及姜黃素的干預(yù)效果[J/CD]. 災(zāi)害醫(yī)學(xué)與救援：電子版,2015,4(4):207-211

[9] 林麗艷，張慧云，何韶衡. IL-6及其受體與炎癥性疾病關(guān)系的新進(jìn)展[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8(4)：680-682

[10] Xu LJ,Xu J，Wang Z. Molecular mechanisms of paraquat-induced acute lung injury:a current review[J]. Drug Chem Toxicol,2014,37(2):130-134

[11] 李闖,郝同琴,劉建萍,等. 百草枯中毒患者血清腫瘤壞死因子-α白細(xì)胞介素-6及百草枯濃度變化的分析[J]. 中國急救醫(yī)學(xué),2010,30(8):739-741

[12] Hua XF,Li XH, Li MM,et al. Doxycycline attenuates paraquat-induced pulmonary fibrosis by downregulating the TGF-β signaling pathway[J]. J Thorac Dis,2017,9(11):4376-4386

[13] 王靚，鄭云輝. 血必凈注射液藥理研究進(jìn)展[J]. 臨床醫(yī)藥實(shí)踐,2016,25(7):542-544

[14] 趙薇，施賢清. 血必凈注射液治療全身炎癥反應(yīng)綜合征患者的臨床研究[J]. 重慶醫(yī)學(xué),2015,44(20):2790-2792