RP-HPLC法測(cè)定平痤合劑中的黃芩苷的含量

覃俏峰，王志強(qiáng)

廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西南寧 530023

平痤合劑是是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科的經(jīng)驗(yàn)方，該方由黃芩、金銀花、枇杷葉、夏枯草、桑白皮、連翹、海浮石、甘草等中藥組方而成，具有清肺熱、驅(qū)風(fēng)邪，院內(nèi)用于痤瘡治療。方中黃芩能補(bǔ)清熱燥濕、涼血解毒，尤善清肺熱，是主藥之一，測(cè)定其有效成分黃芩苷（C21H18O11）的含量應(yīng)該可以有效控制該制劑的質(zhì)量，參考《中國(guó)藥典》（2015 年版）[1]，該實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法對(duì)2016年3—8月配制的6個(gè)批次的平痤合劑中的黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定[2-7]。該制劑原標(biāo)準(zhǔn)中僅有制劑的性狀及一般檢查項(xiàng)目，該方法為有效地控制該制劑的質(zhì)量提供依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀；SPD-20A紫外檢測(cè)器；LC色譜工作站；GH-252型電子分析天平(日本)。

1.2 試藥

實(shí)驗(yàn)藥材均由柳州神農(nóng)中藥飲片廠提供，經(jīng)鑒定均符合2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定。黃芩苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；1107115-201318，供含量測(cè)定用，含量93.3%）；平痤合劑（按處方調(diào)配好中藥，按操作要求及制法配制，備用），配制日期分別為：20160302、20160416、20160506、20160620、20160710、20160824，磷酸為分析純，甲醇為色譜純和分析純，水為超純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

取黃芩苷對(duì)照品適量,精密稱定,加流動(dòng)相制成每1 mL 含 480 μg/mL,即得。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取本品1 m,置25 mL容量瓶，用甲醇定容，經(jīng) 0.45 μm微孔濾膜,即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備

取不含黃芩的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備。

2.4 色譜條件

色譜柱:AgiLentEclipse XDB-C18(250mm×4.6mm，5 μm); 流動(dòng)相:甲醇 ：水：磷酸(47:53：0.2); 流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;進(jìn)樣量:10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng) 280 nm,在此色譜條件下,黃芩苷峰理論塔板數(shù)不小于2 500,與其他色譜峰分離度大于1.5,色譜圖見(jiàn)圖4。

2.5 方法專屬性

按上述色譜條件，取空白溶液，進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖（圖1）；取平痤合劑（黃芩陰性）溶液10 μL進(jìn)樣；記錄色譜圖（圖2）。取黃芩苷對(duì)照品溶液10 μL；記錄色譜圖（圖3）；取平痤合劑供試液10 μL；記錄色譜圖（圖4）；結(jié)果表明，在上述色譜條件下，空白溶液不干擾黃芩苷的含量測(cè)定，平痤合劑（黃芩陰性）溶液不干擾黃芩苷的含量測(cè)定。

圖1 空白溶劑高效液相色譜圖

圖2 平痤合劑（黃芩陰性）圖

圖3 黃芩苷對(duì)照品高效液相色譜圖

圖4 合劑高效液相色譜圖

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

分別精密量取黃芩苷對(duì)照溶液 5、2.5、2、1、0.5、0.25 mL至10 mL量瓶，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為 240、120、96、48、24、12 μg/mL 的黃芩苷溶液，取上述各黃芩苷對(duì)照品溶液；分別進(jìn)樣10 μL。按2.3色譜條件測(cè)定峰面積，以濃度（X）對(duì)照品峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為：Y=0.028X+0.805，r＝1（n＝6）；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃芩苷在 12～240 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性，見(jiàn)表1。

表1 黃芩苷線性范圍試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.7 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液，按上述色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣6次,其相對(duì)保留時(shí)間穩(wěn)定，記錄峰面積，計(jì)算RSD為0.87%，見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下的供試品溶液,室溫下分別在0、2、4、8、12、24 h 測(cè)定, 記錄峰面積, 計(jì)算其 RSD 為0.79%,表明處理后的供試品溶液室溫下在24 h內(nèi)穩(wěn)定，見(jiàn)表3。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取同一批(批號(hào)20160302)，平行6份,按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,依法測(cè)定,結(jié)果黃芩苷的平均含量為2 229 μg/mL,RSD為1.03%。見(jiàn)表4。

表4 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.1 0加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的樣品9份,每份0.5 mL，分為3組，每組3份，分別精密加入黃芩苷對(duì)照品溶液2.0,2.5,3.0 mL按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液,進(jìn)樣10 μL。測(cè)定回收率。

表5 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.11 樣品測(cè)定

按上述色譜條件對(duì)6批樣品進(jìn)行含量測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 不同批次含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

取黃芩苷對(duì)照品，加甲醇配制成一定深度的溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)范圍掃描，結(jié)果在249 nm和282 nm處有吸收峰，最大吸收為282 nm，故選用280 nm為高效液相測(cè)定的波長(zhǎng)。

3.2 流動(dòng)相的選擇

曾以甲醇-水-磷酸（50:50:0.3,V/V）等以不同流速考察[2-8]，結(jié)果對(duì)照品色譜峰有拖尾現(xiàn)象，經(jīng)多次試驗(yàn)結(jié)果比較，流動(dòng)相為甲醇-水:磷酸 (47:53:0.2,V/V)[1]時(shí)，黃芩苷峰峰形最佳，達(dá)到基線分享，和其它成份峰分離度好，滿足含量測(cè)定要求，所以選擇現(xiàn)在的流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 調(diào)定方法

黃芩中的黃芩苷為該類藥品的藥理活性成分，已有較為成熟的含量測(cè)定方法，如紫外分光光度法、HPLC、薄層掃描法、毛細(xì)血管電泳法等，其中HPLC操作快速、靈敏度高且國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道較多，是最為常用的測(cè)定方法流速考察[9]，采用高效液相色譜法對(duì)方中黃芩的黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定[2-7]，具有簡(jiǎn)單、快捷、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、耐用性好的特點(diǎn)，適用于含黃芩苷的中藥以及制劑的含量測(cè)定[10]。根據(jù)以上測(cè)定結(jié)果，本法測(cè)定平痤合劑中的黃芩苷含量應(yīng)不低于2.2 mg/mL，該方法專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定性高、重復(fù)性好，能有效地控制該制劑的質(zhì)量。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：415.

[2]尹香閣，田效志，熊晶晶.清膽和胃丸中芍藥苷和黃芩苷含量測(cè)定的研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，29（1）：82-85.

[3]馬彥江，陳天朝.清熱止暈合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，31（3）：408-410.

[4]安曄，回廣飛，何進(jìn)，等.高效液相色譜法測(cè)定小兒潤(rùn)肺止咳口服液中黃芩苷含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，16 （10）：54-55.

[5]要利明，朱永蒙，趙曉龍.高效液相色譜法在黃芩中黃芩苷含量測(cè)定的應(yīng)用研究[J].山西醫(yī)藥雜志，2013，42（4）：462.

[6]王世宇，黃毅．高效液相色譜法測(cè)定清熱解毒口服液中黃芩苷的含量[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(7):1682－1683．

[7]童芬美，劉杭，王金洲.高效液相色譜法測(cè)定茵梔黃顆粒中黃芩苷的含量[J].中華全科醫(yī)學(xué)，2014，12（12）：2054-2056.

[8]蔡艷芳，劉肖林，中藥黃芩中有效成分的含量測(cè)定及其相應(yīng)圖譜的初步分析[J].臨床合理用藥雜志，2016（28）:90-91.

[9]申去非，張莉，朱鐵梁，等.黃芩苷含量測(cè)定方法研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，2009，26（4）：14-16.

[10]張德靜，牛小彩.復(fù)方地黃合劑及復(fù)方逍遙合劑中黃芩苷含量測(cè)定[J].上海醫(yī)藥，2017，38（5）：66-70.