小分子熱休克蛋白Hsp16.3參與介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌致巨噬細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展

黃丹丹

川北醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川南充 637007

結(jié)核病是世界范圍內(nèi)亟待解決的問題之一[1]。雖然目前聯(lián)合藥物治療對結(jié)核病的蔓延有一定抑制作用，但結(jié)核病仍然是全球造成死亡的十大疾病之一。相關(guān)學(xué)者通過對感染結(jié)核分枝桿菌（MTB）的肺巨噬細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在235種蛋白質(zhì)中，絕大多數(shù)異常表達(dá)的蛋白質(zhì)都參與細(xì)胞凋亡、氧化磷酸化等生物學(xué)過程，證實(shí)了細(xì)胞凋亡在結(jié)核病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色[2]。但另一方面，大量研究表明，MTB感染巨噬細(xì)胞后，可延緩凋亡途徑[3-4]。Jee B等證實(shí)，在小分子熱休克蛋白家族中，Hsp16.3可介導(dǎo)MTB在巨噬細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定生長，并延遲、減少巨噬細(xì)胞凋亡[5]。因此，明確Hsp16.3在MTB中的具體作用，以及其對巨噬細(xì)胞凋亡的影響和具體機(jī)制，對臨床靶向治療藥物開發(fā)具有重要意義。

1 Hsp16.3蛋白分子結(jié)構(gòu)及功能

Hsp16.3分布于MTB，由144個(gè)氨基酸組成，分子量約為16kDa，與ESAT6、CFP10等并稱為Mtb相關(guān)抗原。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)少有或檢測不到該蛋白表達(dá)。Hsp16.3可與巨噬細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)合，抑制巨噬細(xì)胞凋亡，從而增加Mtb的細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定性與生存率。Hsp16.3的C端由3部分組成，分別為C端尾（CTT），IXI模體與C端擴(kuò)展區(qū)（CTE）。CTE主要介導(dǎo)蛋白低聚化解離與輔助增強(qiáng)Hsp16.3的分子伴侶功能。

Alok Kumar Panda等通過CTE基因敲除發(fā)現(xiàn)，CTE敲除后蛋白低聚化解離活性與Hsp16.3的分子伴侶功能均有所降低。見圖1。

圖1 Hsp16.3蛋白分子結(jié)構(gòu)及功能

2 Hsp16.3介導(dǎo)MTB致巨噬細(xì)胞凋亡的作用及其發(fā)生機(jī)制

2.1 Hsp16.3介導(dǎo)MTB致巨噬細(xì)胞凋亡的作用

巨噬細(xì)胞凋亡是機(jī)體自我防御機(jī)制之一，其可有效促進(jìn)MTB抗原暴露，向樹突狀細(xì)胞提成抗原，并促進(jìn)T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。巨噬細(xì)胞凋亡還能抑制MTB在體內(nèi)的播散，激活未感染巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體對MTB的殺傷力。在感染晚期，MTB增殖數(shù)量增多，MTB自身毒力因子、毒素等分泌增強(qiáng)，均可增加MTB抗凋亡能力，延緩巨噬細(xì)胞凋亡進(jìn)程。

Hsp16.3可抑制巨噬細(xì)胞凋亡，增加Mtb的細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定性與存活率。庹清章等證實(shí)，在MTB感染早期、晚期，Hsp16.3的表達(dá)可有效抑制巨噬細(xì)胞凋亡。庹清章等[6]建立小鼠的感染模型，將MTB H37Rv Hsp16.3基因缺失強(qiáng)毒株注入小鼠體內(nèi)，并與對照組比較，發(fā)現(xiàn)在感染早期、晚期，巨噬細(xì)胞凋亡率Hsp16.3基因未缺失組較Hsp16.3基因缺失組顯著增高，且Bcl-2與Caspase-3也有顯著增高。說明在MTB感染早期、晚期，Hsp16.3的表達(dá)可有效抑制巨噬細(xì)胞凋亡。劉云霞等[7]通過流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)，MTB感染巨噬細(xì)胞后，巨噬細(xì)胞內(nèi)Hsp16.3蛋白表達(dá)增多。姚楠等[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，MTB致巨噬細(xì)胞凋亡的程度與Hsp16.3蛋白表達(dá)水平與MTB菌株毒力有關(guān)。MTB菌株毒力較弱時(shí)，巨噬細(xì)胞易發(fā)生早期凋亡。Hsp16.3蛋白表達(dá)水平較高且MTB菌株毒力較強(qiáng)時(shí)，巨噬細(xì)胞凋亡顯著減少。在MTB隱性感染中，Hsp16.3也介導(dǎo)了MTB在細(xì)菌內(nèi)穩(wěn)定繁殖與免疫力低下時(shí)MTB激活。此外，Shi CH等[9]發(fā)現(xiàn)Hsp16.3蛋白可顯著增高M(jìn)TB菌落形成單位的數(shù)量，進(jìn)一步證實(shí)Hsp16.3蛋白對MTB生長繁殖的重要性。

2.2 Hsp16.3介導(dǎo)MTB致巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制

Hsp16.3介導(dǎo)MTB致巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制目前尚不十分清楚，該進(jìn)展歸納總結(jié)了4種可能的調(diào)控機(jī)制，見圖2。

圖2 Hsp16.3介導(dǎo)MTB致巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制

2.2.1 Hsp16.3抑制微管結(jié)合蛋白LC3的表達(dá) Shi CH等[9]證實(shí)，Hsp16.3抑制微管結(jié)合蛋白LC3的表達(dá)，進(jìn)一步影響細(xì)胞凋亡的過程。LC3在細(xì)胞自噬或凋亡過程中具有識別與連接作用，當(dāng)自噬或凋亡過程發(fā)生時(shí)LC3蛋白轉(zhuǎn)變成LC3-II，并介導(dǎo)溶酶體與細(xì)胞識別，促進(jìn)凋亡過程。Hsp16.3抑制LC3表達(dá)后，細(xì)胞質(zhì)量控制（Quality Control）出現(xiàn)異常，巨噬細(xì)胞凋亡過程顯著下降[10]。

2.2.2 Hsp16.3促進(jìn)miR-181a與miR-146a降解Qing-Lin Meng等[11]利用U937細(xì)胞系作為體外巨噬細(xì)胞模型，通過對MTB感染巨噬細(xì)胞中mRNA種類與含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Hsp16.3可抑制miR-181a與miR-146a，并促進(jìn)已產(chǎn)生的miR-181a與miR-146a降解。從而直接參與MTB的免疫逃避過程。

2.2.3 Hsp16.3抑制TLR2表達(dá)及其正常作用 Haibo Su等[12]發(fā)現(xiàn)Rv2029c可通過TLR2介導(dǎo)的下游通路增加MHC-II的表達(dá)，進(jìn)一步刺激CD4+T細(xì)胞活化與凋亡的形成。在MTB感染的巨噬細(xì)胞中，此通路可被Hsp16.3抑制，減少T細(xì)胞活化與凋亡的早期形成。

2.2.4 Hsp16.3促進(jìn)LAG3過表達(dá) 此外，淋巴細(xì)胞活化基因3（LAG3）過表達(dá)時(shí)，CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答顯著減少，并加劇MTB在細(xì)胞內(nèi)繁殖。Hsp16.3參與介導(dǎo)了LAG3的過表達(dá)，且與LAG3對細(xì)胞內(nèi)MTB繁殖有協(xié)同作用[11]。

3 Hsp16.3臨床應(yīng)用前景

3.1 Hsp16.3相關(guān)分子早期檢測

TLR2/TLR12介導(dǎo)的下游通路可增加MHC-II的表達(dá)，進(jìn)一步刺激CD4+T細(xì)胞活化與凋亡的形成，在MTB感染的巨噬細(xì)胞中，Hsp16.3表達(dá)增多，并可抑制TLR2，使TLR2表達(dá)處在較低水平。 Qing-Lin Meng等利用U937細(xì)胞系作為體外巨噬細(xì)胞模型，通過對MTB感染巨噬細(xì)胞中mRNA種類與含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-93-3p在巨噬細(xì)胞感染后顯著下降，且在隱性感染模型中也可檢測到含量變化。以上結(jié)果提示，TLR2/TLR12，Caspase-3，Bcl-2，TNFα，miR-93-3p可作為早期MTB感染的檢測指標(biāo)[13]。

3.2 靶向藥物開發(fā)

如前所述，Hsp16.3表達(dá)增多時(shí)，可抑制TLR2，使TLR2表達(dá)處在較低水平。增加TLR2表達(dá)可作為MTB治療靶點(diǎn)之一。劉紅艷等[14]發(fā)現(xiàn)miR-19b沉默可上調(diào)TLR2表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)MTB誘導(dǎo)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞凋亡。此外，Yongyan Wu等[15]證實(shí)Sp110可與Hsp16.3結(jié)合，阻斷Hsp16.3與細(xì)胞內(nèi)分子的結(jié)合，釋放凋亡相關(guān)分子，使凋亡過程回到正常水平。另一方面，Sp110可與核糖體蛋白Rps3a結(jié)合，上調(diào)前凋亡聚合酶(PARP)表達(dá)水平，進(jìn)一步促感染細(xì)胞凋亡。 以上結(jié)果提示，TLR2，miR-19b，Sp110 可作為MTB治療靶點(diǎn)。

3.3 Hsp16.3疫苗研發(fā)

Geluk等發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)注射卡介苗并不能增強(qiáng)T細(xì)胞針對Hsp16.3的免疫應(yīng)答作用，使疫苗在針對部分靜止期胞內(nèi)寄生MTB或隱形感染患者時(shí)大大減少[16]。C.Shi等發(fā)現(xiàn)，將Hsp16.3或其合成肽注入小鼠時(shí)，細(xì)胞免疫與體液免疫均較注射卡界面有所增強(qiáng)，且MTB增值有所減緩。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，將Hsp16.3或其合成肽設(shè)計(jì)成疫苗，可能會刺激機(jī)體產(chǎn)生更有效的免疫應(yīng)答[17]。

4 展望

該研究進(jìn)展通過對Hsp16.3介導(dǎo)MTB致巨噬細(xì)胞凋亡作用及其發(fā)生機(jī)制的相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行梳理，總結(jié)出 LC3，miR-181a、miR-146a，TLR2 與 LAG3 等 4 條可能的通路，并針對Hsp16.3提出早期分子檢測、靶向藥物開發(fā)、Hsp16.3疫苗研發(fā)等臨床應(yīng)用意見，以期為臨床治療提供幫助指導(dǎo)。但上述凋亡相關(guān)通路還需進(jìn)一步闡明詳細(xì)機(jī)制，Hsp16.3相關(guān)分子檢測技術(shù)、臨床用藥、新型疫苗還有待進(jìn)一步臨床試驗(yàn)。

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