宣痹通瘀方對(duì)急性冠脈缺血大鼠血管新生作用的影響

李雙娣 成光宇 劉迎輝 隋永朋 李洪禹 劉愛(ài)東

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130021)

研究發(fā)現(xiàn)〔1～4〕，Notch信號(hào)通路在促進(jìn)心肌再生、改善心肌缺血、誘導(dǎo)血管新生的過(guò)程中發(fā)揮作用，對(duì)損傷心肌發(fā)揮一定修復(fù)作用。本文主要觀察宣痹通瘀方對(duì)心肌缺血大鼠Notch通路的干預(yù)作用及血管新生的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 110只清潔級(jí)SD大鼠，雌雄各半，重量220～250 g，由遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。室內(nèi)溫度(23±3)℃、室內(nèi)相對(duì)濕度65%～70%，自然光線照明，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2主要藥物和試劑 宣痹通瘀膠囊成分包括延胡索(酒炙)、三七、川芎、郁金、人參、冰片，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院新藥研發(fā)中心提供；陽(yáng)性對(duì)照藥麝香保心丸，由上海和黃藥業(yè)有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字231020068)，規(guī)格:22.5 mg/每丸；單硝酸異山梨酯片20 mg/片，魯南制藥?？缒な荏w蛋白Notch抗體：規(guī)格：1 ml/瓶，產(chǎn)品批號(hào)：JL0972R，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；兔免疫球蛋白(Ig)G-免疫組化試劑盒(SABC即用型)：產(chǎn)品批號(hào)：11H24J20，武漢博士徳生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3儀器設(shè)備 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，型號(hào)：JEDR 801D，江蘇省捷達(dá)科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，型號(hào)：Nikon1671-HA，日本Nikon公司。生理信號(hào)采集系統(tǒng)，型號(hào):Powerlab/8sp，澳大利亞埃德公司產(chǎn)品。醫(yī)學(xué)圖像分析儀，型號(hào):BI-2000型，成都泰盟股份有限公司產(chǎn)品。全自動(dòng)生化分析儀，型號(hào):Selectra Junior，荷蘭威圖科學(xué)儀器公司產(chǎn)品。酶標(biāo)儀，型號(hào):BIOO680，美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品。臺(tái)式高速低溫離心機(jī)，德國(guó)賀利氏公司產(chǎn)品。電子天平，型號(hào):SQP，規(guī)格:PRACTUM313-1CN，序列號(hào):0028892121。賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.4方法

1.4.1模型制備、分組、給藥 大鼠分籠飼養(yǎng)、穩(wěn)定、適應(yīng)環(huán)境1 w。實(shí)驗(yàn)前，應(yīng)用心電圖機(jī)對(duì)受試動(dòng)物進(jìn)行單導(dǎo)聯(lián)(Ⅱ?qū)?lián))檢測(cè)，篩選出心電圖正常的大鼠用于實(shí)驗(yàn)(共108只)。采用快速開(kāi)胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支方法制備急性心肌缺血?jiǎng)游锬Ｐ汀?〕。具體方法如下：將大鼠置于密閉容器中，使其被迫吸入乙醚，進(jìn)入淺麻醉狀態(tài)。將大鼠仰位固定于鼠板上，去除胸部的毛，碘伏局部消毒，在第4～5肋間開(kāi)胸，鈍性分離肌層，打開(kāi)胸腔，拉鉤擴(kuò)胸，暴露心臟，在左心耳根部與肺動(dòng)脈圓錐交界處，相當(dāng)于左冠狀動(dòng)脈起始處下2 mm穿一手術(shù)線結(jié)扎，迅速將心臟送回胸腔，排出進(jìn)入胸腔的氣體及血液，縫合胸壁。再次用碘伏絡(luò)合碘消毒液進(jìn)行皮膚表面消毒，并在腹腔注射適量青霉素，待動(dòng)物蘇醒后，放入籠中常規(guī)飼養(yǎng)。造模5 min后，將所有結(jié)扎大鼠進(jìn)行心電圖監(jiān)測(cè)，運(yùn)用Powerlab/8s型八導(dǎo)數(shù)據(jù)分析記錄儀描記一段Ⅱ?qū)?lián)心電圖，與造模前每只大鼠觀測(cè)的心電圖相比較，觀察ST段偏移幅度，以ST段較前抬高0.2 mV定為造模成功。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為：模型組(n=16)；麝香保心丸組(n=15)：給予麝香保心丸24.3 mg·kg-1·d-1；單硝酸異山梨酯組(n=15)：給予單硝酸異山梨酯7.2 mg·kg-1·d-1，低、中、高劑量組(各n=15)：分別給予宣痹通瘀方0.8、1.6、3.2 g·d-1·kg-1，假手術(shù)組(n=15)：大鼠的操作方法同模型組，只穿線不結(jié)扎。不同劑量組給予不同濃度、相同體積的方法，灌胃體積均為10 ml·kg-1·次-1。術(shù)后次日開(kāi)始給藥，灌胃給藥1次/d，連續(xù)給藥4 w。每天灌胃后1 h進(jìn)行心電圖檢測(cè)。

1.4.2指標(biāo)檢測(cè)

1.4.2.1各組大鼠血清指標(biāo)檢測(cè) 梯度融化-80℃保存的各組血清，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求測(cè)量血清肌鈣蛋白(cTn)I含量。

1.4.2.2各組大鼠心電圖ST段改變、心肌梗死面積對(duì)比 造模后第4周末將大鼠心肌經(jīng)氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染色，通過(guò)形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)計(jì)算出心肌梗死面積占心肌總面積的百分比。

1.4.2.3免疫組織化學(xué)法測(cè)定 取心肌組織切片，按照試劑盒流程對(duì)各組大鼠心肌組織進(jìn)行Notch1指標(biāo)檢測(cè)。光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1造模前后各組大鼠一般狀態(tài)比較 模型組大鼠精神萎靡，進(jìn)食差，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后模型組大鼠死亡6只，其余各組大鼠精神狀態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，活動(dòng)逐漸靈活自如，進(jìn)食飲水正常，其中麝香保心丸組、單硝酸異山梨酯組大鼠死亡4只，高劑量組死亡2只，中、低劑量組各死亡4只、5只。

2.2各組大鼠心肌梗死面積及cTnI含量比較 假手術(shù)組心肌切片未形成梗死區(qū)域；麝香保心丸組、單硝酸異山梨酯組、高、中劑量組心肌梗死面積均明顯低于模型組(P<0.01，P<0.05)；低劑量組心肌梗死面積與模型組比較有減小趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組cTnI含量顯著高于假手術(shù)組(P<0.001)；麝香保心丸組、單硝酸異山梨酯組，高、中、低劑量組cTnI含量顯著低于模型組(P<0.05,P<0.01)。見(jiàn)表1。

2.3各組大鼠心電圖ST段比較 冠狀動(dòng)脈結(jié)扎前，各組心電圖ST段均在正常值范圍，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后5 min、給藥第1～7天與假手術(shù)組比較，模型組各心電圖ST段均明顯抬高(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。給藥第2～7天，高劑量組心電圖ST段上移幅度均明顯低于模型組(P<0.01，P<0.05)；給藥第3～6天，中劑量組心電圖ST段上移幅度均明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01)；給藥第3～5天低劑量組心電圖ST段上移幅度明顯低于模型組(P<0.05)。給藥第2～5天，麝香保心丸組、單硝酸異山梨酯組心電圖ST段上移幅度均明顯低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4各組心肌Notch1陽(yáng)性表達(dá)染色面積及平均光密度比較 與假手術(shù)組比較，模型組Notch1陽(yáng)性表達(dá)染色面積及平均光密度表達(dá)均顯著上升(P<0.001)；與模型組比較，麝香保心丸組、單硝酸異山梨酯組、低劑量組Notch1陽(yáng)性表達(dá)染色面積及平均光密度表達(dá)均有下降趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；高、中劑量組Notch1陽(yáng)性表達(dá)染色面積及平均光密度表達(dá)均顯著下降(P<0.01,P<0.05)。與單硝酸異山梨酯組比較，高、中劑量組Notch1陽(yáng)性表達(dá)染色面積及平均光密度表達(dá)均顯著下降(P<0.01,P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 各組大鼠心肌梗死面積及cTnI含量比較

與模型組比較：1)P<0.05；2)P<0.01；3)P<0.001，下表同

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段變化比較

表3 各組Notch1陽(yáng)性表達(dá)染色面積及平均光密度表達(dá)比較

與模型組比較 : 1)P<0.05，2)P<0.01，3)P<0.001;與單硝酸異山梨酯組比較:4)P<0.05，5)P<0.01

3 討 論

冠心病的病理基礎(chǔ)是冠脈粥樣硬化斑塊形成，造成管腔狹窄，使血流受阻，導(dǎo)致心肌缺血。冠心病的發(fā)病誘因有情緒激動(dòng)、過(guò)勞、飽餐、寒冷等，其中因情緒激動(dòng)誘發(fā)心絞痛的情況最為常見(jiàn)，西醫(yī)理論認(rèn)為：情緒激動(dòng)導(dǎo)致交感神經(jīng)興奮，刺激冠脈血管痙攣收縮，引發(fā)心肌缺血，出現(xiàn)胸悶痛癥狀。中醫(yī)上冠心病屬于“胸痹”“心痛”“厥心痛”等范疇，對(duì)冠心病心絞痛的病因認(rèn)識(shí)，中醫(yī)理論認(rèn)為，情志不遂，肝失疏泄調(diào)達(dá)，氣機(jī)升降出入失常，氣行不暢，氣為血之帥，氣行則血行，氣滯則血停，血行不暢，瘀滯不通，不通則痛發(fā)為胸痹心痛。中西醫(yī)在各自理論的指導(dǎo)下，建立了獨(dú)立的治療方案。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M肌絲束溶解、斷裂，肌絲排列略松散、不整齊，提示急性心肌缺血大鼠模型制作成功。心電圖ST段改變是通過(guò)心臟電活動(dòng)反應(yīng)心肌缺血的一項(xiàng)評(píng)價(jià)指標(biāo)，單硝酸異山梨酯作為治療冠心病的經(jīng)典用藥，對(duì)急性心肌缺血心電圖ST段的干預(yù)作用是毋庸置疑的。本研究表明，宣痹通瘀方、麝香保心丸及單硝酸異山梨酯均有有改善心肌缺血及減少心肌梗死面積的作用。

在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，目前發(fā)現(xiàn)Notch的4種受體和5種配體分別是Notch1、2、3、4及Delta like1、3、4和Jagged1、2〔6〕，其中受體Notch1、Notch4與配體Dell4主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，并在塑造血管的過(guò)程中發(fā)揮功能〔7〕。本實(shí)驗(yàn)提示宣痹通瘀方可以通過(guò)調(diào)節(jié)Notch含量來(lái)發(fā)揮改善心肌缺血的作用，宣痹通瘀高、中、低劑量組干預(yù)Notch1的作用明顯強(qiáng)于單硝酸異山梨酯組，考慮與中藥發(fā)揮益氣化瘀、理氣通絡(luò)作用相關(guān)。

綜上，宣痹通瘀方和麝香保心丸能改善氣滯血瘀型急性心肌缺血大鼠的心肌梗死面積、心電圖ST-T改變，對(duì)心肌缺血有改善，其機(jī)制可能是宣痹通瘀方中重用活血化瘀、益氣通絡(luò)的藥物，能祛瘀生新，從而達(dá)到上調(diào)Notch的作用，進(jìn)而促進(jìn)血管新生而發(fā)揮改善心肌缺血的作用。

4 參考文獻(xiàn)

1Murphy E,Steenbergen C.Ion transport and energetics during cell death and protection〔J〕.Physiology(Bethesda),2008;23:115-23.

2Piper HM,Abdallah Y,Schafer C.The first minutes of reperfusion:a window of opportunity for cardioprotection〔J〕.Cardiovasc Res,2004;61(3):365-71.

3Varadarajan SG,An J,Novalija E,etal.Changes in 〔Na(+)〕(i),compartmental〔Ca(2+)〕,and NADH with dysfunction after global ischemia in intact hearts〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001;280(1):H280-93.

4Tanno M,Miura T.Protecting ischemic hearts by modulation of SR calcium handling〔J〕.Cardiovasc Res,2007;75(3):453-4.

5王 旺，吳曉華，黃 文.結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支造成心肌缺血模型的實(shí)驗(yàn)研究〔J〕.現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011;38(10):1899-900.

6Xie J,Wang W,Si JW,etal.Notch singnaling regulates CXCR4 expression and the migration of mesenchymal stem cell 〔J〕.Cell Immunol,2013;281(1):68-75.

7Kume T.Ligand-dependent Notch signaling in vascular formation 〔J〕.Adv Exp Med Biol,2012;727:210-22.