下調(diào)Jagged1表達(dá)對骨髓瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

張保龍 馬利閣 尹萬樂 李 達(dá) 宗淑君 王 芳 段小珍 尤笑迎

(鄭州人民醫(yī)院骨三科，河南 鄭州 450000)

多發(fā)性骨髓瘤是一種惡性血液系統(tǒng)腫瘤〔1，2〕，是一種無法治愈的重大疾病〔3，4〕。Notch信號通路是細(xì)胞間相互作用的重要通路之一，在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和血管發(fā)生等過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。Jagged1是Notch受體的配體之一，有報道顯示，Jagged1在肝癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞生長、腫瘤血管和免疫細(xì)胞浸潤等過程關(guān)系密切〔5～8〕。Notch信號通路在骨髓瘤發(fā)病過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用〔9〕，但其配體Jagged1在其中的作用未見報道。本研究旨在探討干預(yù)Jagged1表達(dá)對骨髓瘤細(xì)胞增殖的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1RPMI8226細(xì)胞及培養(yǎng) RPMI8226細(xì)胞購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，采用含有10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素和100 U/ml青霉素的RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，孵箱條件為濕度飽和、溫度37℃及CO2體積分?jǐn)?shù)5%。待細(xì)胞貼壁后，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.1.2試劑與儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、青鏈霉雙抗、胎牛血清、OPTI-MEM培養(yǎng)基和磷酸鹽緩沖液(PBS)均購自美國Gibco公司；RNA提取試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙錠(PI)試劑盒、CCK-8試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購于上海碧云天公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔/鼠免疫球蛋白(Ig)G、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、酶切半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3和β肌動蛋白(β-actin)抗體均購自美國Santa Cruz公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、流式細(xì)胞儀、凝膠成像儀、酶標(biāo)儀和電泳儀均購自美國Bio-Rad公司。PCR擴(kuò)增儀購自德國Eppendorf公司，低溫高速離心機(jī)購于德國Sigma公司。引物由上海生工生物合成。

1.2方法

1.2.1分組及轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期RPMI8226細(xì)胞，以每孔25×103個細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞板上，隨機(jī)分為對照組(不做轉(zhuǎn)染)、siRNA control組(轉(zhuǎn)染negative control)和siRNA Jagged1組(轉(zhuǎn)染Jagged1-siRNA)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時，吸去培養(yǎng)基，加無血清OPTI-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。取兩支EP管，一支加入濃度為20 μm siRNA 1μl和OPTI-MEM 49 μl，充分混勻后靜止5 min；另一支：Lipofectamine2000 1 μl和OPTI-MEM 49 μl，充分混勻后靜止5 min。將兩支EP管溶液混合，反應(yīng)20 min。取6孔細(xì)胞板，按照分組，將轉(zhuǎn)染復(fù)合液分別加入siRNA Jagged1組和siRNA control組細(xì)胞中，置于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)5 h，為含血清的完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，鑒定其轉(zhuǎn)染效果。

1.2.2Jagged1 mRNA檢測 采用RT-PCR檢測。以PBS洗滌對照組、siRNA control組和siRNA Jagged1組細(xì)胞后，參照RNA提取試劑盒步驟提取各組RPMI8226細(xì)胞的總RNA。以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。將配制的50 μl反應(yīng)體系(1 μl cDNA，各2 μl上下引物，1 μl Taq 酶，5 μl 10×PCR buffer，4 μl dNTP Mix，31 μl ddH2O)上樣于PCR儀上；其中，每組設(shè)3個重復(fù)，按照95℃預(yù)變性 300 s(1×)，95℃變性 30 s(30×)，58℃退火30 s(30×)；72℃延伸30 s(30×)；72℃ 總延伸10 min(1×)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Jagged1上游引物：5′-AAGTGTGCCTCAAGGAGTATC-3′，下游引物：5′-ACTGTCAGGTTGAACGGTGTC-3′；β-actin上游引物：5′-CAGGTCCAGACGCAGGATGGC-3′，下游引物：5′-TGGGGGCGGCAGCGATGAG-3′。以β-actin為內(nèi)參，2-△△CT法測定各組RPMI8226細(xì)胞中Jagged1 mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.3Jagged1蛋白檢測 采用Western印跡檢測。取1.2.1中的目的細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取各組RPMI8226細(xì)胞的總蛋白，以BCA蛋白檢測試劑盒對總蛋白的濃度及純度進(jìn)行定量。取變性蛋白體積8 μl，每組設(shè)3個復(fù)孔，上樣至濃度為120 g/L十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)中電泳。結(jié)束電泳后，轉(zhuǎn)膜。再將NC膜置于加有5%脫脂奶粉的1×TBST封閉液中，37℃下，振蕩反應(yīng)30 min。加入1 000倍稀釋的特異性一抗(Jagged1抗體和β-actin抗體)，4℃下過夜，以TBST洗滌后，加入5 000倍稀釋的HRP標(biāo)記二抗，37℃下反應(yīng)2 h。洗膜后，以ECL試劑盒顯影，掃描圖片，ImageJ軟件分析各組RPMI8226細(xì)胞中Jagged1蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.4RPMI8226細(xì)胞增殖檢測 采用CCK-8法檢測。取對數(shù)生長期RPMI8226細(xì)胞，以50×103個細(xì)胞150 μl/孔接種至96孔細(xì)胞板上，待細(xì)胞融合度70%以上時，按照1.2.1中的方法分組和轉(zhuǎn)染。每組設(shè)置4個復(fù)孔，重復(fù)3次。在轉(zhuǎn)染6 h后，分別孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 d、2 d或3 d后，棄上清液，每孔加入100 μl濃度為10%CCK-8溶液，孵育2 h后，以酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞在490 nm處的吸光度(OD)值。

1.2.5RPMI8226細(xì)胞周期分布及凋亡檢測 采用FCM檢測。細(xì)胞周期實驗：轉(zhuǎn)染48 h后，制備對照組、siRNA control組和siRNA Jagged1組的細(xì)胞懸液(約20×103個細(xì)胞)。以PBS(預(yù)冷)洗滌細(xì)胞后，加入1 ml 70%冰乙醇固定過夜，離心后，以PBS洗滌，加入濃度為50 mg/L PI 1 ml染色，于4℃下避光反應(yīng)30 min，上流式細(xì)胞儀檢測。細(xì)胞凋亡實驗：轉(zhuǎn)染48 h后，制備對照組、siRNA control組和siRNA Jagged1組的細(xì)胞懸液，以PBS洗滌后離心。加入300 μl結(jié)合緩沖液制成含有約20×103個細(xì)胞的懸液，加入Annexin V-FITC 10 μl和PI 5 μl進(jìn)行雙染色，避光反應(yīng)20 min后，補(bǔ)加結(jié)合緩沖液200 μl，上流式細(xì)胞儀檢測凋亡率。

1.2.6CyclinD1、Bcl-2和酶切caspase-3蛋白檢測 采用Western印跡檢測。轉(zhuǎn)染48 h后，收集對照組、siRNA control組和siRNA Jagged1組細(xì)胞，經(jīng)提取總蛋白、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉過程后，加入均為1 000倍稀釋的一抗(CyclinD1抗體、Bcl-2抗體和酶切caspase-3抗體)，低溫孵育過夜后，加入5 000倍稀釋的二抗，2 h反應(yīng)結(jié)束后，以ECL顯影，Image J軟件分析RPMI8226細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2和酶切caspase-3蛋白的相對表達(dá)量。具體步驟參照1.2.3。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染Jagged1-siRNA下調(diào)RPMI-8226細(xì)胞中Jagged1的表達(dá) RT-PCR和Western印跡檢測結(jié)果顯示，與對照組(0.99±0.03，0.38±0.03)相比，轉(zhuǎn)染48 h后siRNA control組Jagged1 mRNA和蛋白表達(dá)水平(1.02±0.05，0.41±0.02)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而siRNA Jagged1組(0.17±0.02，0.12±0.01)均顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測各組RPMI8226細(xì)胞中 Jagged1蛋白表達(dá)

2.2下調(diào)Jagged1表達(dá)抑制RPMI8226細(xì)胞增殖 與對照組相比，轉(zhuǎn)染1～3 d后，siRNA Jagged1組RPMI8226細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制(P<0.05)，而siRNA control組無明顯改變(P>0.05)。見表1。

表1 下調(diào)Jagged1表達(dá)對RPMI8226細(xì)胞增殖的影響

與對照組比較：1)P<0.05；下表同

2.3下調(diào)Jagged1表達(dá)誘導(dǎo)RPMI-8226細(xì)胞周期阻滯和凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后，siRNA Jagged1 G0/G1期細(xì)胞比例和凋亡率較對照組均顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低(P<0.05)；但siRNA control組細(xì)胞周期分布和凋亡率較對照組無明顯變化(P>0.05)。見表2。

2.4下調(diào)Jagged1抑制CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)并促進(jìn)酶切caspase-3蛋白表達(dá) 與對照組比較，siRNA control組細(xì)胞中CyclinD1、Bcl-2和酶切caspase-3蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但siRNA Jagged1組CyclinD1、Bcl-2蛋白表達(dá)明顯減弱，酶切caspase-3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05)，見表3，圖2。

表2 下調(diào)Jagged1表達(dá)對RPMI-8226細(xì)胞周期和凋亡的影響

圖2 Western印跡檢測Cyclin D1、Bcl-2和 酶切caspase-3蛋白表達(dá)

組別CyclinD1/β-actinBcl-2/β-actin酶切caspase-3/β-actin對照組0.47±0.060.55±0.050.15±0.02siRNA control組0.50±0.050.53±0.060.13±0.03siRNA Jagged1組0.23±0.021)0.27±0.031)0.49±0.061)

3 討 論

Jagged1是一種單次跨膜糖蛋白，位于細(xì)胞膜上，是Notch受體配體中的重要一員，除了參與造血過程外，還可通過調(diào)控Notch信號通路在腫瘤血管形成、腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用〔10，11〕。高表達(dá)Jagged1與乳腺癌、腎癌和肺癌等淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、病理分級和總生存期差等關(guān)系密切〔12～14〕。Dai等〔15〕在結(jié)腸癌細(xì)胞中，以慢病毒Jagged1-siRNA下調(diào)Jagged1表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力降低，細(xì)胞被阻滯在G0/G1期；劉國燕等〔16〕通過特異性沉默卵巢癌中高表達(dá)的Jagged1基因發(fā)現(xiàn)，卵巢癌裸鼠移植瘤的生長受到抑制。此外，Jagged1對腫瘤化療藥物還有一定的增敏作用。葉欣等〔17〕在小細(xì)胞肺癌中研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Jagged1的表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞對化療藥物的敏感性，同時還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期。目前，在骨髓瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究中，Notch信號通路的研究較多，但對其配體Jagged1研究較少〔9，18〕。本研究結(jié)果提示，Jagged1基因在骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

腫瘤的形成發(fā)展與細(xì)胞增殖和凋亡的失衡關(guān)系密切，而細(xì)胞增殖又受細(xì)胞周期的影響。CyclinD1是細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期不可或缺的特異性周期蛋白，Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，而caspase-3是caspase家族中的執(zhí)行凋亡蛋白，三者與骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展、惡性程度和預(yù)后等密切相關(guān)〔19～21〕。本研究結(jié)果提示，在骨髓瘤中，Jagged1可能通過上調(diào)CyclinD1和Bcl-2及下調(diào)酶切caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)揮促細(xì)胞增殖的作用，與袁磊等〔22〕研究結(jié)果吻合。

綜上，下調(diào)Jagged1表達(dá)可抑制骨髓瘤RPMI-8226細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與下調(diào)Cyclin D1和Bcl-2蛋白表達(dá)及上調(diào)酶切caspase-3蛋白表達(dá)有關(guān)。

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