干擾PDK1表達(dá)對血管瘤細(xì)胞增殖、凋亡及PI3K/Akt信號通路的影響

陳德才 王 雅 馬從乾 楊 軻 陳 輝

(南陽市中心醫(yī)院血管外科，河南 南陽 473200)

血管瘤是皮膚腫瘤中常見的良性腫瘤，在我國的發(fā)病率為5%～10%〔1〕。既往研究證明，血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管生成與血管瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系〔2〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖過度和血管生長過快是血管瘤主要的生物學(xué)特征〔3〕。目前，血管瘤的分子和細(xì)胞學(xué)發(fā)病機(jī)制仍然不清楚，普遍認(rèn)為由增生期、消退期、消退完成期組成，其中血管瘤細(xì)胞的增殖與凋亡對血管瘤的演進(jìn)具有重要作用〔4〕。因此，血管瘤細(xì)胞的增殖、凋亡機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)之一。3-磷酸肌醇依賴性激酶(PDK)1對細(xì)胞的增殖、凋亡具有重要的調(diào)節(jié)作用〔5〕。因此，本實(shí)驗(yàn)通過siRNA特異性抑制小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤細(xì)胞EOMA中PDK1表達(dá)，研究其表達(dá)量下降對內(nèi)皮細(xì)胞增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)主要材料 小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞瘤細(xì)胞系EOMA購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，DMEM購自美國Hyclone公司，噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒購自美國Amresco公司，Annexin V-FITC凋亡試劑盒購自德國Miltenyi Biotec公司，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗體、蛋白激酶B(Akt)抗體、磷酸化(p)-Akt抗體、β肌動蛋白(actin)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自美國Cell Signaling公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng) EOMA細(xì)胞置于T25培養(yǎng)瓶中，加入5 ml含10% FBS、青霉素、氯霉素的新鮮DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞匯合度達(dá)到80%左右更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化細(xì)胞，每隔2～3 d按1∶3的比例進(jìn)行傳代。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 細(xì)胞轉(zhuǎn)染前24 h，將EOMA細(xì)胞接種于6孔板上，每孔2×106個細(xì)胞，放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時，在Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明的指導(dǎo)下進(jìn)行轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)分3組：siRNA-PDK1組中加入siRNA-PDK1、Lipofectamine 2000，siRNA-NC組中加入 siRNA-NC、 Lipofectamine 2000，對照組加入等量的培養(yǎng)基和 Lipofectamine 2000，輕輕混勻后室溫孵育15 min，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，免疫印跡試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.4MTT法檢測細(xì)胞增殖活力 取生長狀態(tài)良好的對數(shù)期細(xì)胞，0.25%胰酶消化成單細(xì)胞懸液，分別接種到96孔板上，每孔1×106個細(xì)胞，每組5個復(fù)孔，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入20 μl/孔MTT溶液，避光孵育4 h，取出培養(yǎng)板，每孔加入150 μl二甲基亞砜，充分振蕩，在酶標(biāo)儀490 nm波長下檢測每孔的光密度值(OD值)，計(jì)算細(xì)胞增殖活力。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)期細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/ml，分為三組分別接種在6孔板上，轉(zhuǎn)染后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞至10 ml流式離心管內(nèi)，加入10 μl Annexin V-FITC，充分混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，加入10 μl PI，振動混勻，采用流式細(xì)胞儀測定各組細(xì)胞凋亡情況，重復(fù)3次。

1.6免疫印跡試驗(yàn)檢測細(xì)胞中Akt、p-Akt、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量 棄去上清，收集細(xì)胞，加入RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰上反應(yīng)10 min，離心，收集上清，BCA法檢測蛋白濃度。加入SDS緩沖液調(diào)整蛋白濃度，100℃煮沸變性5 min，配制10%的分離膠和5%濃縮膠，取50 μg蛋白質(zhì)加入上樣孔，120 V電泳至溴酚藍(lán)遷移至凝膠底部，取出凝膠，切除多余凝膠，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，置于5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗稀釋液，4℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次5 min，加入HRP標(biāo)記羊抗兔二抗，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min，滴加化學(xué)發(fā)光試劑，用凝膠成像儀掃描，目的蛋白灰度值/β-actin灰度值表示蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1免疫印跡試驗(yàn)檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果 與對照組(0.852±0.063)相比，siRNA-NC組細(xì)胞中PDK1蛋白的表達(dá)量(0.838±0.539)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，siRNA-PDK1組細(xì)胞中PDK1蛋白的表達(dá)量(0.462±0.033)顯著降低(P<0.05)。見圖1。

2.2干擾PDK1表達(dá)對細(xì)胞增殖活性的影響 siRNA-NC組細(xì)胞增殖活性〔(99.489±0.055)%〕與對照組〔(100.232±0.054)%〕相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，siRNA-PDK1組細(xì)胞活力〔(76.528±5.662)%〕顯著低于對照組(P<0.05)。

2.3干擾PDK1表達(dá)對細(xì)胞凋亡率的影響 與對照組〔(9.487±1.052)%〕相比，siRNA-NC組細(xì)胞凋亡率〔(10.523±1.456)%〕差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，siRNA-PDK1組細(xì)胞凋亡率〔(27.489±5.759)%〕顯著升高(P<0.05)。

2.4干擾PDK1表達(dá)對細(xì)胞中Akt、p-Akt、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量的影響 與對照組相比，siRNA-NC組細(xì)胞中Akt、p-Akt、酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，siRNA-PDK1組細(xì)胞中Akt蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，p-Akt蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，酶切Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見圖2，表1。

圖1 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中PDK1蛋白表達(dá)

圖2 沉默PDK1的表達(dá)對細(xì)胞中Akt、p-Akt、 酶切Caspase-3蛋白的表達(dá)量的影響

組別Aktp-Akt酶切Caspase-3對照組0.855±0.0690.578±0.0650.445±0.068siRNA-NC組0.862±0.0730.564±0.0630.421±0.062siRNA-PDK1組0.860±0.0790.356±0.0241)0.635±0.0521)

與對照組相比：1)P<0.05

3 討 論

皮膚血管瘤是一種常見的良性腫瘤，其組織學(xué)特點(diǎn)為內(nèi)皮細(xì)胞過度增殖〔6〕。血管瘤可產(chǎn)生于身體的多個部位，以皮膚和皮下組織中較常見，常采用激光、放射、激素、干擾素等多種治療方法，其中以手術(shù)治療效果較好〔7〕。但血管瘤若長在眼、耳、鼻等重要器官的特殊部位，很難以手術(shù)治療進(jìn)行根除，因此較多采用非手術(shù)的方式。目前，臨床上采用的非手術(shù)方式中較多的是激素治療，長期使用的負(fù)效應(yīng)較大〔8〕，所以亟需尋找一種新的非手術(shù)治療方法。PDK1屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族的成員之一，分子量為63 kD，含有PH結(jié)構(gòu)域，與4，5-二磷酸化磷酸肌醇、3，4-二磷酸化磷酸肌醇和3，4，5-三磷酸化磷酸肌醇等磷酸肌醇類化合物有很強(qiáng)的分子親和力，是細(xì)胞中很多重要信號通路的關(guān)鍵因子〔9〕。研究表明PDK1在人體的多種組織中均表達(dá)，對腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程等發(fā)揮重要作用〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PDK1參與血管瘤細(xì)胞的增殖、凋亡的過程。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt參與腫瘤細(xì)胞過度增殖、血管生長、放化療的保護(hù)作用，對維持血管瘤生物學(xué)特征具有重要的調(diào)節(jié)作用〔11〕。當(dāng)機(jī)體受到外界刺激，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，誘導(dǎo)激活PI3K磷酸化，促進(jìn)第二信使3，4，5-三磷酸化磷脂酰肌醇的產(chǎn)生，第二信使可與具有PH結(jié)構(gòu)域的蛋白如PDK1、Akt結(jié)合，從而促進(jìn)Akt磷酸化，激活或抑制下游通路靶基因表達(dá)，發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡的作用〔12，13〕。PDK1是Akt的上游基因，對PI3K/Akt信號通路及下游靶基因Caspase-3的活性均具有重要的調(diào)節(jié)作用〔14〕。PDK1可通過PI3K/Akt信號通路調(diào)節(jié)細(xì)胞一系列的生物學(xué)作用如增殖、凋亡、分化、周期等。研究〔15，16〕表明PDK1介導(dǎo)的PI3K/Akt信號通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如乳腺癌、胰腺癌、血管瘤等，且PDK1在這些腫瘤組織中都是高表達(dá)。提示PDK1在血管瘤中可能通過影響PI3K/Akt信號通路的激活進(jìn)而促使酶切Caspase-3高表達(dá)，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡過程。

綜上所述，沉默PDK1的表達(dá)可抑制血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，作用機(jī)制可能與PI3K/Akt信號通路介導(dǎo)的下游靶基因的表達(dá)有關(guān)，為血管瘤治療方法的創(chuàng)新提供了理論基礎(chǔ)。

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