六味地黃丸對(duì)糖尿病大鼠血管功能的影響及抗氧化應(yīng)激機(jī)制

于 洋 趙 寧 張 娜

(錦州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，遼寧 錦州 121001)

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能不全(ECD)已經(jīng)成為2型糖尿病(T2DM)及其血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的始動(dòng)關(guān)鍵因素及病理基礎(chǔ)，并貫穿于整個(gè)病程的始終〔1〕。研究表明內(nèi)皮源型一氧化氮(NO)可引起內(nèi)皮依賴性舒張功能，介導(dǎo)血管舒張〔2〕。T2DM造成的氧化應(yīng)激(OS)損傷不但是糖尿病(DM)及血管并發(fā)癥的重要機(jī)制，也加速了ECD的發(fā)生發(fā)展〔3〕。六味地黃丸(LWDHP)是著名中成藥，廣泛用于臨床，尤其在高血脂、脂肪肝、T2DM和肥胖等代謝性疾病的防治中突顯優(yōu)勢〔4〕。本實(shí)驗(yàn)通過觀察LWDHP對(duì)DM大鼠血管內(nèi)皮舒張功能、NO含量、丙二醛(MDA)濃度及相關(guān)基因蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(PRMT)1表達(dá)的影響，探討LWDHP 在DM血管病變中的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 30只雄性SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量160～190 g，購自遼寧長生生物技術(shù)有限公司〔許可證號(hào)：SCXK(遼)2010-0001〕。

1.2主要試劑 LWDHP(濃縮丸)，北京同仁堂(國藥準(zhǔn)字Z19993068)；PRMT1一抗，鼠抗人GAPDH一抗，美國Proteintech Group公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠IgG二抗，Cell Signaling Technology公司；RT-PCR試劑盒，TaKaRa公司；鏈脲佐菌素(STZ)，Sigma公司；總NO檢測試劑盒，MDA檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所。

1.3T2DM大鼠模型建立及藥物干預(yù) 健康雄性SD大鼠，適應(yīng)性喂食1 w后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)和造模組(20只)。正常對(duì)照組喂食普通飼料，造模組喂食高脂飼料(100 g/L豬油+100 g/L蛋黃粉+1.0 g/L 膽鹽+10 g/L 維生素+789 g/L基礎(chǔ)飼料)。5 w后大鼠禁食不禁水14～16 h，造模組腹腔注射STZ 30 mg/kg(用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配成濃度為10 g/L的STZ溶液)，正常對(duì)照組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，1次/d，連續(xù)2 d。1 w后鼠尾靜脈取血監(jiān)測血糖水平，以兩次隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L作為T2DM模型成功的標(biāo)志，繼續(xù)喂養(yǎng)高脂飼料4 w以穩(wěn)定模型。T2DM模型大鼠隨機(jī)分為DM模型組和LWDHP治療組，每組10只。LWDHP治療組給予3 ml/kg的藥物混懸液進(jìn)行灌胃(用生理鹽水配制，劑量為1.2 g/kg)，正常對(duì)照組和DM模型組以等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃8 w。給藥期間DM模型組與LWDHP治療組大鼠繼續(xù)喂食高脂飼料。8 w后，3組大鼠禁食12 h，斷頭處死。取血管組織，觀察內(nèi)皮依賴性血管舒張功能，檢測NO濃度、MDA含量及PRMT1的表達(dá)。

1.4離體胸主動(dòng)脈內(nèi)皮依賴性血管舒張功能測定 大鼠斷頭處死，迅速打開胸腹腔，取出胸主動(dòng)脈置于0℃ 的Kreb液(NaCl 119 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.5 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO4·7H2O 1.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，葡萄糖11.1 mmol/L，pH7.4)中。去除血管周圍的結(jié)締組織和脂肪組織，清除血管內(nèi)的血液，將血管剪切成約3 mm的血管環(huán)。將血管環(huán)懸掛于含8 ml Kreb液(37℃)的浴槽中，持續(xù)通入95% O2+5% CO2的混合氣體。血管環(huán)的一端連接張力換能器，記錄血管環(huán)張力的變化。血管環(huán)的初始張力為2 g，平衡60 min后，加入KCl(使浴槽中終濃度為50 mmol/L)溶液預(yù)刺激2次。血管環(huán)張力平衡后，向浴槽內(nèi)加入1×10-6mol/L的苯腎上腺素收縮血管，判斷血管活性，然后用Kreb液沖洗至基線，血管環(huán)穩(wěn)定后開始實(shí)驗(yàn)，期間每15 min換Krebs液1次，藥物和液體均為直接加入浴液中。用1×10-6mol/L的苯腎上腺素誘發(fā)血管收縮達(dá)100%，依次加入終濃度分別為1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6、1×10-5、1×10-4mol/L的乙酰膽堿(ACh)誘導(dǎo)血管舒張，計(jì)算舒張百分比(%)= 藥物引起舒張的幅度張力/苯腎上腺素最大收縮張力×100%。沖洗血管，重新平衡到初始張力，改用濃度為10-8～10-4mol/L的內(nèi)皮非依賴性血管舒張劑——亞硝酸鈉(NaNO2)舒張血管，以證明血管內(nèi)皮功能失調(diào)。

1.5離體胸主動(dòng)脈NO含量和MDA濃度的測定 取整條主動(dòng)脈約5 cm于液氮中凍存?zhèn)錅yNO含量和MDA濃度，測定時(shí)取適量主動(dòng)脈，加入1∶10冷生理鹽水，勻漿后離心，取上清液，按NO和MDA檢測試劑盒的說明進(jìn)行操作，測定光密度值，檢測各組血管組織中NO含量和MDA濃度。

1.6RT-PCR測定血管組織中PRMT1 mRNA的表達(dá) 提取血管總RNA，用RT-PCR 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及聚合酶鏈反應(yīng)。β-actin上游引物序列：5′-ACACGAAAGCAATGCTATCACCTC-3′，下游引物序列：5′-TGACAGCAGTCGGTTGGAGCGA-3′，擴(kuò)增片段長度153 bp。反應(yīng)條件為94℃ 2 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，40個(gè)循環(huán)。PRMT1上游引物序列：5′-GAGGCCGCGAACTGCATCAT-3′，下游引物序列：5′-TGGCTTTGACGATCTTCACC-3′，擴(kuò)增片段長度350 bp。反應(yīng)條件：退火60℃，30個(gè)循環(huán)。通過凝膠成像系統(tǒng)以PRMT1條帶光密度值和對(duì)應(yīng)的β-actin條帶光密度值的比值表示PRMT1 mRNA的表達(dá)量。

1.7Western印跡測定血管組織中PRMT1蛋白表達(dá) 提取血管總蛋白，調(diào)整各組的蛋白質(zhì)上樣量(40 μg)，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉37℃水浴震蕩封閉1 h，加入PRMT1一抗(1∶500稀釋)，4℃過夜。TBST清洗3次，5 min/次，HRP標(biāo)記IgG二抗(1∶2 000稀釋)，TBST清洗4次，5 min/次，37℃水浴震蕩2 h，DAB顯色，掃描條帶，以GAPDH作為內(nèi)參，PRMT1和GAPDH蛋白表達(dá)強(qiáng)度的灰度比值顯示PRMT1相對(duì)表達(dá)量。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析后進(jìn)行組間LSD分析。

2 結(jié) 果

2.1LWDHP對(duì)DM大鼠血管舒張功能的影響 正常對(duì)照組，ACh可濃度依賴性舒張苯腎上腺素收縮的血管環(huán)，最大舒張效應(yīng)為(94.50±2.15)%。DM模型組ACh最大舒張反應(yīng)為(61.82±2.34)%，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明動(dòng)脈的舒張功能出現(xiàn)明顯障礙。LWDHP治療組ACh最大舒張效應(yīng)為(78.66±3.46)%，與DM模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明主動(dòng)脈對(duì)ACh的舒張反應(yīng)較DM模型組明顯增強(qiáng)。各組動(dòng)脈對(duì)內(nèi)皮非依賴性舒張劑NaNO2的最大舒張效應(yīng)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明DM模型大鼠血管舒張功能障礙是由于血管內(nèi)皮功能異常導(dǎo)致的。見圖1。

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與DM模型組比較：2)P<0.01圖1 各組大鼠主動(dòng)脈對(duì)ACh和NaNO2介導(dǎo)的 血管舒張功能的比較

2.2各組動(dòng)脈組織中NO含量和MDA濃度的測定 DM模型組NO含量明顯降低，MDA濃度明顯增加，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。LWDHP治療組的NO含量升高，MDA濃度下降，與模型組比較顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 LWDHP對(duì)血管組織中NO含量和MDA濃度的影響

與正常對(duì)照組比較：1)P<0.01；與DM模型組比較：2)P<0.01

2.3LWDHP對(duì)血管組織中PRMT1 mRNA表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組(0.33±0.000 9)比較，DM模型組血管組織內(nèi)PRMT1 mRNA的表達(dá)量(0.70±0.000 1)顯著升高(P<0.01)。與DM模型組比較，LWDHP治療組PRMT1 mRNA表達(dá)量(0.50±0.000 7)明顯下降(P<0.01)，說明LWDHP預(yù)處理可以抑制PRMT1 mRNA的表達(dá)量。見圖2。

圖2 各組血管組織PRMT1 mRNA表達(dá)的比較

2.4LWDHP對(duì)血管組織中PRMT1 蛋白表達(dá)的影響 與正常對(duì)照組(0.45±0.000 5)比較，DM模型組血管組織內(nèi)PRMT1 蛋白的表達(dá)量(0.62±0.000 9)同樣顯著升高(P<0.01)。與DM模型組比較，LWDHP治療組PRMT1蛋白表達(dá)量(0.36±0.000 7)同樣下降(P<0.01)，意味著LWDHP同樣也可以抑制PRMT1蛋白的表達(dá)。見圖3。

圖3 各組血管組織PRMT1蛋白表達(dá)的比較

3 討 論

血管內(nèi)皮細(xì)胞(EC)是覆蓋在血管腔內(nèi)表面的高度分化的單層細(xì)胞，是血管壁和血液之間的分界細(xì)胞。正常的EC可保證血管的反應(yīng)性和血管壁的完整性，是防御DM不良反應(yīng)的第一道防線，而DM患者血管內(nèi)皮損傷是疾病發(fā)生發(fā)展的首發(fā)因素〔5〕。本實(shí)驗(yàn)觀察到，T2DM大鼠的胸主動(dòng)脈對(duì)ACh的血管舒張反應(yīng)較正常對(duì)照組明顯降低，提示DM大鼠的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能存在障礙。采用LWDHP灌胃治療的大鼠胸主動(dòng)脈對(duì)ACh的血管舒張反應(yīng)增加，表明內(nèi)皮依賴性血管舒張功能得以改善。三組大鼠對(duì)內(nèi)皮非依賴性舒張劑NaNO2的血管舒張反應(yīng)無明顯差異，說明LWDHP治療組和DM模型大鼠胸主動(dòng)脈對(duì)外源性NaNO2擴(kuò)血管的反應(yīng)是相同的，即DM并沒有降低血管平滑肌細(xì)胞對(duì)NO的敏感性，另一方面也證實(shí)了LWDHP并不是通過增加血管平滑肌細(xì)胞對(duì)NO的敏感性來發(fā)揮其改善血管舒張功能的。這一結(jié)果提示LWDHP 可保護(hù)DM大鼠的血管EC，改善DM所致的內(nèi)皮依賴性血管舒張功能障礙。

NO是一種內(nèi)皮源性信號(hào)分子，能引起內(nèi)皮依賴性舒張功能，介導(dǎo)血管舒張。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)〔6〕，輸注胰島素后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物下肢血流量較基礎(chǔ)值增加了2倍，但加用抑制劑后血管舒張作用消失，提示胰島素的血管舒張作用是NO依賴性，而且胰島素是通過增加內(nèi)皮源性NO的釋放來實(shí)現(xiàn)血管舒張功能的。培養(yǎng)的EC實(shí)驗(yàn)也證明胰島素抵抗的細(xì)胞裂解液中NO含量釋放減少〔7〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM模型組血管組織中NO含量明顯降低，而LWDHP能增加NO含量，進(jìn)一步證實(shí)LWDHP對(duì)DM內(nèi)皮損傷的改善作用，提示LWDHP對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用與其能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮NO的生成有著密切關(guān)系。

高糖環(huán)境下體內(nèi)的OS反應(yīng)增強(qiáng)，使體內(nèi)的活性氧大量積聚，從而促進(jìn)DM及其他血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。同時(shí)，在氧自由基的攻擊下膜脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，最重要的終產(chǎn)物之一MDA也增加〔8〕。因此， MDA含量的變化可間接反映氧自由基的生成量，從而了解氧自由基對(duì)細(xì)胞損傷的程度。另外，DM發(fā)生發(fā)展過程中的OS反應(yīng)導(dǎo)致的大量活性氧可以催化一種關(guān)鍵酶——PRMT1酶的活化，它可以催化一種新的心血管疾病的危險(xiǎn)因子——非對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)的生成〔9〕。ADMA是內(nèi)皮源型一氧化氮合酶(eNOS)的競爭抑制劑，可以降低其活性，降低NO的合成。當(dāng)eNOS的底物L(fēng)-精氨酸的活性缺乏時(shí)，此時(shí)的L-精氨酸在eNOS的作用下能產(chǎn)生更多的活性氧自由基，加重OS反應(yīng)〔10〕。本實(shí)驗(yàn)中，DM模型組血管組織中MDA濃度明顯增加，PRMT1 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著升高，證明了活性氧可使PRMT1進(jìn)一步增多，最終使NO合成減少，進(jìn)一步惡化ECD，這樣就可能形成一個(gè)加重OS反應(yīng)的惡性循環(huán)。同時(shí)也檢測到LWDHP治療后MDA濃度下降，PRMT1 mRNA和蛋白的表達(dá)量顯著降低，揭示了LWDHP可以抑制PRMT1表達(dá)、降低OS損傷，改善受損的EC狀態(tài)，增加胰島素敏感性，從而延緩DM及其血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。

既然PRMT1酶作用的底物是ADMA，ADMA又是eNOS的競爭抑制劑，而且eNOS是NO合成的關(guān)鍵酶，那么在DM及血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的EC氧化損傷的這條通路中，LWDHP對(duì)DM大鼠血管組織中ADMA的生成和eNOS的表達(dá)是否有影響，還需進(jìn)一步研究。

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