胸腺素β4促進結腸癌細胞上皮間質轉化的機制

寧 登 陳 勁 程 琪 劉秋夢 李 雪 姜 立

(華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院膽胰外科，湖北 武漢 430030)

結腸癌為常見的消化道腫瘤，有著惡性率高、預后差、病死率高等特點，其發(fā)病和致死率在消化道腫瘤中居于前列〔1〕。結腸癌病情的嚴重程度與腫瘤細胞的侵襲與轉移、耐藥性密切相關。上皮間質轉化(EMT)，指上皮細胞在一定條件下向間充質細胞轉化的現(xiàn)象，能讓腫瘤細胞獲得并增強侵襲與轉移、耐藥性等能力〔2，3〕，嚴重影響結腸癌的臨床治療，顯著降低患者生活質量和預后質量。胸腺素β4(Tβ4)是一種小分子極性多肽，在細胞內起著重要的作用，廣泛存在于生物體的各個組織之中。已有研究〔4〕表明，Tβ4過表達往往伴隨著E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達減弱與腫瘤細胞遷移能力增強，即表現(xiàn)為促進EMT。然而Tβ4促進EMT的具體機制尚未明朗。整合素相連激酶(ILK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可與細胞內許多骨架蛋白相互作用，參與調節(jié)細胞形態(tài)、細胞黏附等。ILK在多種腫瘤細胞中均表達異常，ILK的高表達與腫瘤轉移密切相關。ILK的表達受多種機制調節(jié)，而Tβ4是否可通過調節(jié)ILK表達從而影響結腸癌細胞的EMT表型及轉移能力尚不清楚。本研究采用過表達及沉默策略，結合實時定量PCR(qRFPCR)、Western印跡、免疫組化等多種分子生物學技術，檢測結腸癌細胞中Tβ4的表達改變是否會改變細胞ILK表達、EMT表型及細胞侵襲轉移能力，為發(fā)生轉移的結腸癌患者的治療提供新的治療策略和理論依據。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng)及試劑 人結腸癌細胞SW480購自上海酶研生物科技有限公司，于37℃，5% CO2的條件中無菌培養(yǎng)。培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的L-15細胞培養(yǎng)基(含200 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素)。L-15培養(yǎng)基購自賽默飛世爾公司。胎牛血清購自Biological Industries公司。Taq2000 DNA聚合酶購自上海前塵生物科技有限公司。穩(wěn)定轉染細胞系篩選所用的G418購自中科瑞泰公司。硝酸纖維素膜購自頗爾公司。人E-cadherin單克隆抗體、人N-catenin單克隆抗體、人Akt多克隆抗體均購自Cell Signal公司。人p-Akt(Ser473)單克隆抗體購自上海信裕公司。人ILK單克隆抗體和人β-tubulin多克隆抗體購自Abcam公司。所有其他生化試劑均采用國產分析純。

1.2病例選擇 29例經同濟醫(yī)院病理確診并手術切除的結腸癌組織，均選取了癌組織中心、癌旁組織和遠端正常黏膜組織為對照。病例術前均已接受一個療程的5-氟脲嘧啶(5-FU)加亞葉酸鈣(LV)聯(lián)合化療方案，但未接受放療。其中女7例，男22例。按結腸癌TNM病理分期標準歸類如下：Ⅰ期3例，Ⅱ期21例，Ⅲ期5例。標本均用10%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.3Tβ4過表達的穩(wěn)定轉染細胞的構建及培養(yǎng) 在37℃、5%CO2環(huán)境下，將SW480細胞加入含有10%胎牛血清的L-15培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。選取生長情況良好的數對細胞按3×105接種于6孔板中。當細胞融合率達到70%左右時，轉染帶G418抗性的Tβ4過表達質粒，該質粒購自維真生物公司，將Tβ4的CDS區(qū)序列克隆至pBK-CMV載體。將細胞分為兩組，分別轉染48 h、72 h，觀察Tβ4在不同時間點的表達水平。以0.8 mg/ml濃度的G418培養(yǎng)基培養(yǎng)2 w，4 w后獲得穩(wěn)定表達的細胞株，分別命名為Tb3(轉染48 h)、Tb4(轉染72 h)。

1.4Tβ4干擾腺病毒的構建及感染 將Tβ4基因與GFP DNA片段分別鏈接到pShuttle-CMV載體上，使用PmeⅠ線性化，再轉染至BJ5183細胞中。使用PacⅠ酶切斷后若出現(xiàn)3 kb或4.5 kb DNA片段，則證明轉染成功。獲得的腺病毒基因組經PacⅠ酶線性化之后，通過脂質體轉染入Ad293細胞中。48 h之后，用反復凍融提取病毒，并繼續(xù)通過Ad293細胞擴增。制備出足夠的病毒之后，在無血清的環(huán)境中感染細胞1 h。再將培養(yǎng)基置換成完全培養(yǎng)基，在標準條件中培養(yǎng)細胞。

1.5qRT-PCR 用Trizol試劑(美國Invitrogen公司)提取細胞總RNA。按RNA反轉錄試劑盒說明制備cDNA第一鏈，使用Taq2000 DNA 聚合酶按以下引物序列擴增Tβ4，正向：5′-ATGTCTGACAAACCCGATATG-3′，反向：5′-GCTAGCCAGACCATCAGATG-3′。用SYRB Green染料(大連寶生物工程有限公司)法對mRNA水平進行相對定量檢測。Tβ4定量引物正向：5′-ATGTCTGACAAACCCGATATG-3′，反向：5′-GCTAGCCAGACCATCAGATG-3′，內參引物β-Actin序列如下：正向：TCATGAAGTGTGACGTGGACAT；反向：CTCAGGAGGAGCAATGATCTTG。反應采用兩步法，在實時熒光定量PCR儀(美國伯樂Bio-RADiCycler實時熒光定量PCR儀7500)上進行，反應程序為：95℃，10min；95℃，30s；60℃，1 min。重復第二步，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt方法表示各基因mRNA相對表達量，進行3次獨立實驗。病毒感染前后分別按說明實時定量測量Tβ4基因的表達。將Tβ4與β-actin比值作為Tβ4表達水平的參數，進行定量分析。每次測試重復3次。

1.6總蛋白、胞質蛋白提取 總蛋白提取按照RIPA細胞裂解液操作流程裂解。參照說明書操作，收集細胞；加入冰上預冷的 PBS，重懸細胞沉淀；離心后棄上清，稱量細胞質量，根據說明書推薦量加入冰預冷的CERⅠ溶液(含有蛋白酶抑制劑)，渦旋振蕩15 s重懸細胞，冰浴10 min；加入CERⅡ溶液，渦旋5 s后冰上孵育1 min，再渦旋震蕩5 s，4℃離心10 min，吸取上清即得到胞漿蛋白。

1.7Western印跡檢測蛋白表達水平 用聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳，然后轉染硝酸纖維膜(NC膜)，室溫封閉1 h；4℃結合ILK、E-cadherin、β-cadherin、α-Parvin、GAPDH一抗過夜；TBST洗3次，每次10 min；室溫結合羊抗兔IgG-HRP為二抗1h；TBST洗3次，每次10 min ；ECL發(fā)光系統(tǒng)顯示蛋白質表達。

1.8Tβ4、ILK、E-cadherin的免疫組織化學染色法 石蠟包埋經甲醛固定的樣本。切片，常規(guī)脫蠟至水。以Tβ4染色為例，以人多克隆Tβ4抗體為一抗(1∶200)，生物素標記兔抗為二抗(1∶500)，加入鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結復合物。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，充分水洗后脫水，制片，隨機選取視野照相(奧林巴斯顯微鏡CX31)，免疫組織化學結果分析由染色強度(弱、中、強分別為1，2，3分)和陽性染色百分比(<25%為1分，25%～75%為2分，>75%為3分)兩者的評分乘積決定，小于4分為低表達，大于等于4分為高表達。ILK和 E-cadherin與此類似。

2 結 果

2.1Tβ4促進SW480結腸癌細胞發(fā)生EMT 本研究構建了Tβ4過表達的穩(wěn)定轉染細胞系，并選取Tβ4表達最高的兩個穩(wěn)轉克隆命名為Tb3和Tb4進行后續(xù)研究。PCR結果顯示，與親本SW480細胞和穩(wěn)定轉染空載的對照細胞(BK)相比，Tb3和Tb4細胞中的Tβ4顯著升高(圖1)。形態(tài)學上，Tb3和Tb4細胞排列松散、無規(guī)律，呈游離樣分別；細胞輪廓呈拉長紡錘形態(tài)，部分細胞伴有絲狀偽足形成(圖2)。Western印跡檢測結果顯示，在Tb3與Tb4細胞中，E-cadherin顯著降低而N-catenin顯著上升(圖3)。

圖1 PCR方法檢測各細胞的Tβ4表達水平

圖2 Tb3、Tb4的形態(tài)(×400)

圖3 Western印跡檢測各細胞的E-cadherin、 N-catenin表達水平

2.2Tβ4過表達的細胞中ILK表達及活性上升 在Tβ4過表達細胞中，不論是全胞溶解產物(總蛋白，T)還是胞液部分(胞質蛋白，C)之中，ILK的含量都較高，而α-Parvin的含量并無變化(圖4A)，p-Akt(Ser473)表達增強，提示ILK活性增加(圖4B)。見表1、表2。

A：采用Western印跡方法檢測各細胞的總ILK(T)、α-Parvin(T)及胞質ILK(C)、α-Parvin(C)水平；B：采用Western印跡方法檢測各細胞的p-Akt(Ser473)、AKT水平圖4 Tβ4過表達的細胞中ILK表達及活性上升

指標SWBKTb3Tb4ILK(T)1.00±0.041.23±0.072.44±0.111)2)3.10±0.171)2)ILK(C)1.03±0.031.25±0.072.53±0.091)2)3.32±0.211)2)α-Parvin(T)1.01±0.040.56±0.050.84±0.071.05±0.04α-Parvin(C)1.03±0.050.55±0.070.53±0.061.28±0.05

與SW比較：1)P<0.05；與BK比較：2)P<0.05；表2同

表2 各細胞體外激活酶試驗結果

2.3Tβ4過表達促進結腸癌細胞侵襲、轉移 傷痕愈合和transwell方法結果顯示，Tβ4過表達細胞轉移能力顯著增強(圖5A)，侵襲能力也顯著升高(圖5B)。

2.4干擾Tβ4表達可下降細胞中ILK表達，抑制細胞侵襲、轉移 在Ad-Tβ4 AS感染24 h與48 h之后，Tβ4的表達顯著下降，而且，受Ad-Tβ4 AS感染的Tb3和Tb4細胞中，ILK也明顯下降，傷痕愈合、Transwell方法檢測抑制Tβ4后，細胞的轉移、侵襲能力均顯著下降，見表3，圖6。

2.5在人結腸癌組織中Tβ4的表達水平與E-cadherin表達及ILK活性的相關性 本研究對29例結腸癌標本采用免疫組化法檢測組織標本中Tβ4，E-cadherin和ILK的表達水平，結果見圖7，見表4。

Tβ4 mRNA相對量(%)0 h12 h24 h48 hILK相對表達量(%)48 h96 hTb3100.0±0.1103.1±11.249.2±5.61)48.3±2.01)0.50±0.020.48±0.01Tb4100.0±0.197.3±1.561.6±3.21)56.1±7.11)0.71±0.080.50±0.02

與0 h比較：1)P<0.05

圖7 采用免疫組化方法檢測組織標本中Tβ4，E-cadherin和ILK的表達水平(DAB，×400)

Tβ4(+)(-)患者人數209ILK(+)16(80.0)0(0.0)ILK(-)4(20.0)9(100)E-cadherin(+)2(10.0)6(66.7)E-cadherin(-)18(90.0)3(33.3)

Tβ4的過表達與ILK的表達呈正相關(P=0.035)，而與E-cadherin的表達呈負相關(P=0.043)

3 討 論

EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程，上皮細胞失去了細胞極性、失去與基底膜的連接，從而獲得了較高的遷移與侵襲、降解細胞外基質的能力，在腫瘤轉移過程中發(fā)揮關鍵作用。發(fā)生EMT的細胞其形態(tài)學上會發(fā)生顯著變化，主要表現(xiàn)為細胞極性喪失、出現(xiàn)紡錘形的成纖維樣的細胞形態(tài)，出現(xiàn)絲狀偽足。E-cadherin的表達降低或丟失是EMT的最重要的標志性變化〔5〕。已有研究〔6～8〕證實，由E-cadherin表達降低引起的EMT，將減弱E-cadherin依賴性的胞間黏附作用，同時增加細胞的運動性，從而促進腫瘤細胞的侵襲，加快腫瘤的惡性變化。

目前已證實，ILK的激活能夠下調E-cadherin的表達水平，促進EMT，從而引發(fā)腫瘤細胞的遷移與腫瘤的惡化〔9～11〕。同時，多項研究〔9，12～14〕表明，ILK激活的癌癥患者預后生存、生活質量顯著降低。Tβ4是一種促淋巴細胞生成因子，廣泛存在于大多數組織和細胞中，參與了免疫調節(jié)、創(chuàng)傷愈合、組織再生等需要細胞遷移運動的生物過程〔15～17〕。本研究中，從統(tǒng)一的結腸癌細胞系中幾種穩(wěn)定的Tβ4過表達克隆系(Tb3和Tb4)的形態(tài)呈纖維狀、分散狀，提示這些細胞中已經發(fā)生了EMT。經檢測，在這些新細胞中，E-cadherin的含量顯著降低，與之前類似研究〔4〕的結果一致，對于Tb3和Tb4細胞來說，無論是細胞整體還是胞質的溶解產物中，檢測到N-catenin的含量顯著上升。由于N-catenin mRNA含量并沒有上升，這里的上升極有可能是由于其穩(wěn)定性提高。因為在Tβ4過表達的SW480細胞中，ILK蛋白的表達和ILK酶的活性升高，而相反的，作為ILK激活蛋白之一的α-parvin卻并沒有發(fā)生變化。這提示此處的ILK激活與其-parvin復合物無關。本研究隨后用攜帶Ad-Tβ4 AS的腺病毒感染了Tβ4過表達的細胞以抑制Tβ4，這些受感染的細胞中ILK活性明顯下降。更重要的是，免疫組化試驗結果證實，在人體結腸癌細胞中，Tβ4的表達水平與ILK呈正相關，與E-cadherin呈負相關。

綜上所述，在人結腸癌細胞中，Tβ4相關的EMT與ILK的激活密不可分。這種作用不僅僅表現(xiàn)在破壞胞間連接，還表現(xiàn)為下調E-cadherin的表達。因此Tβ4的過表達會促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。

4 參考文獻

1Torre LA，Bray F，Siegel RL，etal.Global cancer statistics，2012〔J〕.CA Cancer J Clin，2015；65(2)：87-108.

2Gao L，Liu J，Zhang B，etal.Functional MUC4 suppress epithelial-mesenchymal transition in lung adenocarcinoma metastasis〔J〕.Tumour Biol，2014；35(2)：1335-41.

3陳瀟雅，余長云.上皮間質轉化與腫瘤轉移的研究進展〔J〕.中國耳鼻咽喉顱底外科雜志，2015；21(4)：346-50.

4Sribenja S，Wongkham S，Wongkham C，etal.Roles and mechanisms of β-thymosins in cell migration and cancer metastasis：an update〔J〕.Cancer Invest，2013；31(2)：103-10.

5Pieters T，van Roy F.Role of cell-cell adhesion complexes in embryonic stem cell biology〔J〕.J Cell Sci，2014；127(Pt 12)：2603-13.

6Talchai C，Xuan S，Lin HV，etal.Pancreatic β cell dedifferentiation as a mechanism of diabetic β cell failure〔J〕.Cell，2012；150(6)：1223-34.

7Yang YL，Chen MW，Xian L.Prognostic and clinicopathological significance of downregulated E-cadherin expression in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC)：a meta-analysis〔J〕.PLoS One，2014；9(6)：e99763.

8Onder S，Taskin OC，Sen F，etal.High expression of SALL4 and fascin，and loss of E-cadherin expression in undifferentiated/dedifferentiated carcinomas of the endometrium：an immunohistochemical and clinicopathologic study〔J〕.Medicine(Baltimore)，2017；96(10)：e6248.

9Yen CF，Kim SH，Liao SK，etal.Increased expression of integrin-linked kinase during decidualization regulates the morphological transformation of endometrial stromal cells〔J〕.Fertil Steril，2017；107(3)：803-12.

10Berardi DE，F(xiàn)lumian C，Campodónico PB，etal.Myoepithelial and luminal breast cancer cells exhibit different responses to all-transretinoic acid〔J〕.Cell Oncol(Dordr)，2015；38(4)：289-305.

11Zheng YP，Zhang SB，Wang F，etal.Effects of lentiviral RNA interference-mediated downregulation of integrin-linked kinase on biological behaviors of human lens epithelial cells〔J〕.Int J Ophthalmol，2016；9(1)：21-8.

12張書俊.整合素連接激酶、醌氧化還原酶-1和增殖細胞核抗原在肝細胞癌中的表達及意義〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(6)：1511-3.

13Lamouille S，Xu J，Derynck R.Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2014；15(3)：178-96.

14Li J，Zhang H，Wu J，etal.Prognostic significance of integrin-linked kinase1 overexpression in astrocytoma〔J〕.Int J Cancer，2010；126(6)：1436-44.

15Hong KO，Lee JI，Hong SP，etal.Thymosinβ4 induces proliferation，invasion，and epithelial-to-mesenchymal transition of oral squamous cell carcinoma〔J〕.Amino Acids，2016；48(1)：117-27.

16Ryu YK，Lee JW，Moon EY.Thymosin beta-4，actin-sequestering protein regulates vascular endothelial growth factor expression via hypoxia-inducible nitric oxide production in hela cervical cancer cells〔J〕.Biomol Ther(Seoul)，2015；23(1)：19-25.

17Piao Z，Hong CS，Jung MR，etal.Thymosinβ4 induces invasion and migration of human colorectal cancer cells through the ILK/AKT/β-catenin signaling pathway〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2014；452(3)：858-64.