老年濕熱證與寒濕證膝關(guān)節(jié)炎患者血清MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β水平的表達(dá)及意義

譚永振 梁 文 陳一凡 林秀娟

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510260)

膝關(guān)節(jié)炎是一種由膝關(guān)節(jié)軟骨變性或(和)骨質(zhì)增生所引起的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，老年人為易發(fā)群體〔1〕。目前，對膝關(guān)節(jié)炎的診斷主要根據(jù)臨床癥狀和影像學(xué)檢查，但影像學(xué)檢查鑒別不同類型的膝關(guān)節(jié)炎敏感性差〔2〕。中醫(yī)學(xué)將膝關(guān)節(jié)炎歸屬于“痹證”范疇，濕熱痹證與寒濕痹證是痹證的兩種基本類型〔3〕。研究表明〔4〕，膝關(guān)節(jié)炎與多種細(xì)胞因子有關(guān)。本研究旨在探討老年濕熱證與寒濕證膝關(guān)節(jié)炎患者血清中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP抑制劑(TIMP)-1、腫瘤壞死因子(TNF)-α及白細(xì)胞介素(IL)-1β的表達(dá)及意義，為老年膝關(guān)節(jié)炎的臨床診治提供參考。

1 資料和方法

1.1一般資料 選擇2015年5月至2017年5月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治老年膝關(guān)節(jié)炎患者70例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合膝關(guān)節(jié)炎的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)〔5〕，即有反復(fù)勞損或創(chuàng)傷史、膝關(guān)節(jié)疼痛和僵硬、活動時疼痛加重、膝關(guān)節(jié)活動時可捫及摩擦音、X線片檢查提示髕骨及脛骨平臺關(guān)節(jié)緣呈唇樣增生。(2)中醫(yī)辨證分型為濕熱證或寒濕證〔6〕：濕熱證標(biāo)準(zhǔn)：游走性關(guān)節(jié)疼痛，涉及一個活動關(guān)節(jié)，活動不便，局部燒熱紅腫，痛不可觸，得冷則舒，可伴有皮下結(jié)節(jié)或紅斑，舌質(zhì)紅，舌苔黃且膩，脈滑數(shù)活活浮數(shù)；寒濕證標(biāo)準(zhǔn)：關(guān)節(jié)及肌肉疼痛酸楚，關(guān)節(jié)屈伸不利，可涉及多個關(guān)節(jié)，遇寒則痛盛，得熱則痛緩，舌質(zhì)淡，舌苔薄白，脈浮或浮緩。(3)采血前1d內(nèi)未使用過免疫抑制劑及細(xì)胞毒性藥物治療。(4)患者簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并系統(tǒng)性紅斑狼瘡、硬皮病及干燥綜合征等自身免疫系統(tǒng)疾病者；(2)伴嚴(yán)重肝、腎、心、腦、肺及骨髓等重要器官功能障礙者；(3)有精神疾病史及心理障礙者。70例患者根據(jù)中醫(yī)辨證分型分為濕熱證組(37例)和寒濕證組(33例)。濕熱證組：男11例，女26例；年齡60～84歲，平均(67.47±4.78)歲；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動性評分系統(tǒng)〔7〕(DAS28)評分2～8分，平均(5.62±1.07)分；關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷程度分級：Ⅰ級4例，Ⅱ級7例，Ⅲ級11例，Ⅳ級15例；體質(zhì)指數(shù)(BMI)19～26 kg/m2，平均(23.62±1.42)kg/m2。寒濕證組：男9例，女24例；年齡60～86歲，平均(68.05±4.66)歲；DAS28評分2～8分，平均(5.58±1.13)分；軟骨損傷程度分級：Ⅰ級3例，Ⅱ級6例，Ⅲ級10例，Ⅳ級14例；BMI 18～26 kg/m2，平均(23.58±1.46)kg/m2。另選擇同期進(jìn)行體檢的健康老年人30例為對照組，男9例，女21例；年齡60～84歲，平均(68.12±3.97)歲；BMI 19～26 kg/m2，平均(23.14±1.12)kg/m2。三組性別、年齡、BMI等資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，濕熱證組的DAS28評分、軟骨損傷程度與寒濕證組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法 對象均禁食12 h后于清晨采集空腹靜脈血4 ml，室溫放置2 h或4℃過夜，以4℃ 1 000 r/min離心20 min，離心半徑100 mm，取血清保存于-20℃冰箱待測。采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法〔8〕檢測血清MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β水平，MMP-3、TIMP-1和TNF-α試劑盒購于上海晶抗生物工程有限公司，IL-1β試劑盒購于上?；馍锛夹g(shù)有限公司，試驗過程中所用的酶標(biāo)儀為BIO-RAD公司(美國)生產(chǎn)的680型酶標(biāo)儀，洗板為BIO-TEK公司(美國)的ELX-50型洗板。檢測過程中均嚴(yán)按照試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作，主要步驟：標(biāo)準(zhǔn)品根據(jù)說明書稀釋為5個梯度，在各梯度孔中加入50 μl的加樣量，將樣本稀釋液40 μl添加至酶標(biāo)包被板上的待測樣本孔，再將待測樣品10 μl加入待測孔，混勻后用封板膜封板并置于37℃溫育30 min，蒸餾水洗滌后除空白孔外其余每孔添加酶標(biāo)試劑50 μl，封板后置于37℃溫育30 min，洗滌后先加入顯色劑A(試劑盒配套)50 μl，繼續(xù)加入顯色劑B 50 μl，混勻后在37℃條件下顯色15 min，每孔加入50 μl終止顯色液，當(dāng)藍(lán)色變?yōu)辄S色時說明反應(yīng)終止；使用curve expert 1.4專業(yè)曲線制作軟件，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、吸光度(OD)值為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將檢測樣本的OD值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合方程式，計算出樣品濃度再乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的實際濃度(檢測中若樣品的OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線的上限則適當(dāng)稀釋后重測)。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較膝關(guān)節(jié)炎患者與對照組血清MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β水平。(2)膝關(guān)節(jié)炎患者根據(jù)關(guān)節(jié)鏡下軟骨損傷程度分級進(jìn)行分組，比較各組患者血清MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β水平。(3)比較濕熱證組患者與寒濕證組患者血清

MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS21.0軟件，計量資料多組比較采用F檢驗，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗；軟骨損傷程度比較采用秩和檢驗。

2 結(jié) 果

2.1兩組細(xì)胞因子水平比較 膝關(guān)節(jié)炎組患者血清MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組細(xì)胞因子水平比較

2.2濕熱證組與寒濕證組細(xì)胞因子水平比較 濕熱證組患者血清MMP-3、TIMP-1水平顯著高于寒濕證組(P<0.05)；濕熱證組患者血清TNF-α、IL-1β水平與寒濕證組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 濕熱證組與寒濕證組細(xì)胞因子水平比較

2.3細(xì)胞因子與老年膝關(guān)節(jié)炎患者軟骨損傷程度的關(guān)系 Ⅰ級組、Ⅱ級組、Ⅲ級組、Ⅳ級組患者血清MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β表達(dá)水平整體比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨著軟骨損傷程度加重，血清MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β表達(dá)水平逐漸增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 不同軟骨損傷程度患者各檢測指標(biāo)比較

與Ⅰ級組比較:1)P<0.05；與Ⅱ級組比較:2)P<0.05；與Ⅲ級組比較:3)P<0.05

3 討 論

膝關(guān)節(jié)炎歸屬于中醫(yī)學(xué)的“痹證”范疇，即其是一種以關(guān)節(jié)、肌肉、筋骨及脈等部位疼痛為表現(xiàn)，以關(guān)節(jié)屈伸不利、腫大、麻木、畸形及肌肉萎縮為基本特征的疾病〔9〕。既往研究顯示〔10〕，膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病與MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β等多種細(xì)胞因子水平有關(guān)，但檢測這些細(xì)胞因子水平是否有助于鑒別不同證候類型的膝關(guān)節(jié)炎的問題尚不十分明確，加上老年患者體質(zhì)、代謝、免疫及細(xì)胞功能等方面的特殊性，以上所述的各種因子水平是否有助于鑒別老年膝關(guān)節(jié)炎的不同證候類型尚待進(jìn)一步證實。中醫(yī)學(xué)對膝關(guān)節(jié)炎證候類型的研究表明，膝關(guān)節(jié)炎被分為濕熱痹阻型、寒濕痹阻型、氣血虛弱型、陽氣不足型、風(fēng)濕痹阻型及肝腎陰虛型等6種基本的類型〔3〕，其中以濕熱痹阻型和寒濕痹阻型最為常見。

本研究顯示，膝關(guān)節(jié)炎組血清MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β水平顯著高于對照組，這與既往研究〔11〕基本一致。本研究還表明MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β參與了老年膝關(guān)節(jié)炎的發(fā)病及病情進(jìn)展過程，通過檢測MMP-3、TIMP-1、TNF-α及IL-1β水平可對疾病的診斷及軟骨損傷程度評估提供有效的參考信息，其中檢測MMP-3和TIMP-1水平有助于鑒別診斷老年濕熱證與寒濕證膝關(guān)節(jié)炎。MMP-3又稱基質(zhì)溶解素-1，可降解多種類型的膠原、基質(zhì)中的蛋白多糖及層黏蛋白等，是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解中最重要的酶之一，MMP-3水平升高可破壞關(guān)節(jié)軟骨病激活其他蛋白酶，進(jìn)而加速軟骨破壞〔12〕。TIMP-1是MMP-3的抑制物，廣泛分布于機(jī)體組織及體液中，可1∶1與活化的MMP-3結(jié)合形成復(fù)合物，進(jìn)而抑制MMP-3活性及血管增殖，在機(jī)體MMP-3分泌增加時可引起軟骨破壞，進(jìn)而引起反饋性保護(hù)作用增強(qiáng)，TIMP-1分泌增加以抑制MMP-3的破壞作用〔13〕。TNF-α細(xì)胞來源廣泛，具有廣泛的生物學(xué)活性(如拮抗腫瘤、參與炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答等)〔14〕；IL-1β是一種致炎細(xì)胞因子，其水平升高可刺激滑膜產(chǎn)生炎癥，廣泛參與水腫、組織破壞等多種病理損傷過程〔15〕。TNF-α和IL-1β是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎損傷程度、關(guān)節(jié)破壞及炎癥的重要介質(zhì)，本研究亦表明，TNF-α和IL-1β參與老年膝關(guān)節(jié)炎發(fā)病及軟骨損傷過程，但其在鑒別膝關(guān)節(jié)炎的癥候類型方面無意義。

本研究提示通過檢測血清MMP-3和TIMP-1水平可鑒別診斷老年濕熱證與寒濕證膝關(guān)節(jié)炎，但由于本研究樣本含量較小，未進(jìn)一步探討其具體的截斷值。因此在后續(xù)研究中，將收集更多樣本進(jìn)行專題研究，進(jìn)一步探明血清MMP-3和TIMP-1水平在老年濕熱證與寒濕證膝關(guān)節(jié)炎鑒別診斷中的具體截斷值。

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