四逆酸棗仁湯合方對(duì)失眠大鼠海馬GABAARα1、γ2及NKCC1的影響

林炳岐，馬捷，劉燕，于雪，范盎然，張煒悅，戴寧，張蔚，劉夢(mèng)，溫佳雨，李峰(北京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院-中醫(yī)診斷系,北京 100029)

失眠癥是臨床常見疾病，失眠癥是以頻繁且持續(xù)的入睡困難或睡眠維持困難，并導(dǎo)致睡眠滿意度不足為特征的睡眠障礙[1]。由于現(xiàn)代社會(huì)的特點(diǎn)，人們的工作壓力增大，生活節(jié)奏加快，導(dǎo)致睡眠不規(guī)律，失眠的人數(shù)呈不斷的上升趨勢(shì)，尤其腦力勞動(dòng)者最為嚴(yán)重。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致失眠的病因很多，但是由于現(xiàn)代社會(huì)人們心理負(fù)擔(dān)的加重，情志因素已經(jīng)成為失眠的主要原因[2]。同時(shí)，在臨床的實(shí)踐和文獻(xiàn)分析中，很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)失眠的病位在心，但是和肝臟的影響密切相關(guān)[3]。人的正常睡眠和海馬中的γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)能神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)，它是存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，能夠抑制神經(jīng)系統(tǒng)，具有保護(hù)神經(jīng)的作用，能夠起到催眠、鎮(zhèn)靜和抗焦慮等功能[4]。GABA所起到的神經(jīng)保護(hù)作用是通過(guò)結(jié)合其A受體來(lái)完成的，A受體中以GABAARα1和GABAARγ2型受體最多，也是GABAA受體重要的功能基團(tuán)。這些受體都含有配體門控氯離子通道蛋白，在Na+-K+-Cl-協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(NKCC1)的作用下，使Cl-快速內(nèi)流，聚集于神經(jīng)元內(nèi)，當(dāng)GABAA受體被激活時(shí)產(chǎn)生神經(jīng)元的抑制保護(hù)作用。四逆散和酸棗仁湯是從肝論治失眠的經(jīng)典方劑，具有疏肝解郁、養(yǎng)血安神的作用。本實(shí)驗(yàn)觀察四逆酸棗仁湯合方對(duì)失眠大鼠GABA能傳導(dǎo)系統(tǒng)中GABAARα1、GABAARγ2和NKCC1的影響，探討四逆酸棗仁湯合方在GABA能傳導(dǎo)系統(tǒng)中的作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本研究選用清潔級(jí)SD健康雄性大鼠90只，體質(zhì)量180～200 g。動(dòng)物購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證編號(hào)為SCXX(京)2016-0002。大鼠飼養(yǎng)于清潔級(jí)動(dòng)物房，40 W日光燈照射，光照節(jié)律為12 h(06:00—18:00)；室內(nèi)溫度為(23±1)℃，相對(duì)濕度為30%～40%；正常大鼠飼料喂養(yǎng)，自由飲水。

1.2 藥物

四逆散：柴胡6 g，白芍6 g，枳實(shí)6 g，炙甘草6 g；酸棗仁湯：酸棗仁15 g，川芎9 g，知母9 g，茯苓9 g，炙甘草3 g；四逆酸棗仁湯合方：酸棗仁15 g，川芎9 g，知母9 g，茯苓9 g，炙甘草9 g，柴胡6 g，白芍6 g，枳實(shí)6 g。以上生藥均由北京同仁堂醫(yī)藥有限責(zé)任公司提供，并由北京創(chuàng)立有限責(zé)任公司加工成浸膏備用，出膏率分別為：18.3%、17.6%、18.1%，4℃保存。艾司唑侖：1盒，常溫保存，備用，購(gòu)自中日友好醫(yī)院。

1.3 主要試劑和儀器

對(duì)氯苯丙氨酸(PCPA)(Sigma，美國(guó))；戊巴比妥鈉(Sigma，美國(guó))；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(索萊寶生物科技有限公司)；兔抗GAPDH(Protein tech，美國(guó))，兔抗GABAARα1(Protein tech，美國(guó))，兔抗GABAARγ2(Protein tech，美國(guó))，NKCC1(Protein tech，美國(guó))，兔二抗(中山金橋)；Reveraid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，美國(guó))，PCR Master Mix(Thermo，美國(guó))，PCR引物合成(上海生工公司)；酶標(biāo)儀Multiskan GO(Thermo，美國(guó))；電泳槽(Bio-RAD，美國(guó))，電轉(zhuǎn)槽(Bio-RAD，美國(guó))；Alpha Innotech凝膠成像儀(FLUORCHEM，美國(guó))；CFX96 PCR檢測(cè)儀(Bio-RAD，美國(guó))，PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD，美國(guó))，Gene Amp PCR System 9700(Applied Biosystems，美國(guó))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 失眠模型復(fù)制

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，自由進(jìn)食、進(jìn)水，保持墊料干燥，7 d后稱體質(zhì)量編號(hào)，隨機(jī)分為正常組(15只)和造模組(75只)，造模組腹腔注射PCPA混懸液[5-6]。PCPA用量按400 mg/10 mL/kg，用弱堿性生理鹽水配置成混懸液備用，正常組腹腔注射等體積的弱堿性生理鹽水，于每日8:00—8:30進(jìn)行，兩組連續(xù)注射2 d。第1次腹腔注射36 h后，造模組大鼠出現(xiàn)晝夜節(jié)律缺失，白天與夜晚活動(dòng)不斷，易激惹，整體觀察和正常組不同，提示造模成功。將復(fù)制成功的模型大鼠隨機(jī)分為模型組、西藥組、四逆散組、酸棗仁湯組、合方組，并設(shè)置空白對(duì)照正常組。

2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和給藥

正常組：連續(xù)7 d生理鹽水灌胃；失眠模型復(fù)制成功的大鼠75只，按隨機(jī)數(shù)字表法分成以下5組，每組15只。模型組：連續(xù)7 d生理鹽水灌胃；西藥組：連續(xù)7 d艾司唑侖灌胃；四逆散組：連續(xù)7 d四逆散浸膏灌胃；酸棗仁湯組：連續(xù)7 d酸棗仁湯浸膏灌胃；四逆酸棗仁湯合方組(以下簡(jiǎn)稱：合方組)：連續(xù)7 d四逆酸棗仁湯合方浸膏灌胃。各用藥組根據(jù)中藥浸膏的出膏率和大鼠給藥體表面積公式計(jì)算出各組大鼠給藥量。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 一般狀態(tài)

觀察大鼠的活動(dòng)狀態(tài)、精神狀態(tài)、皮毛顏色、進(jìn)食量、飲水量和對(duì)外界刺激的反應(yīng)等。

2.3.2 體質(zhì)量變化

記錄各組大鼠的每天體質(zhì)量，觀察各組大鼠每天體質(zhì)量的變化。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1 取材

給藥結(jié)束后第2天，大鼠戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血、斷頭，冰上快速剝離大鼠海馬，置于液氮中快速冷凍，再轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱冷凍保存待測(cè),每組隨機(jī)選取5只海馬進(jìn)行RCR檢測(cè)，隨機(jī)選取6只海馬進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

2.4.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用Trizol破碎各組大鼠海馬腦組織，離心取上清，依次加入氯仿、異丙醇等提取總RNA；根據(jù)總RNA濃度和反轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為：退火25 ℃，5 min，延伸42 ℃，60 min，失活79 ℃，5 min；GABAARα1mRNA上游引物：5′-AGCTATACCCCTAACTTAGCCAGG-3′，下游引物：5′-AGAAAGCGATTCTCAGTGCAGAGG-3′；GABAARγ2mRNA上游引物：5′-CTTCTTCGGATGTTTTCCTTCAGG-3′，下游引物：5′-CATAGGGTATTAGATCGTTGGACT-3′；NKCC1mRNA：上游引物：5′-TTACTACCTGCGCACCTTCG-3′，下游引物：5′-TCCAGCTCATCGTGGAACTC-3′；β-actin上游引物：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s～60 ℃ 30 s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，讀取PCR軟件內(nèi)循環(huán)閾值(CT值)，采用ΔΔCT法處理結(jié)果，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算GABAARα1、GABAARγ2和NKCC1的相對(duì)表達(dá)量，以2-ΔΔCT表示。

2.4.3 Western Blot

用ripa裂解液提取大鼠海馬腦組織蛋白，采用BCA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度，根據(jù)總蛋白濃度配平，使各樣本蛋白等量，取40 μg蛋白樣品，電泳分離，再電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，0.5%的脫脂奶粉封閉1h后，分別加入一抗GABAARα(1∶2 000)、GABAARγ2(1∶2 000)、NKCC1(1∶2 000)，GAPDH(1∶50 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST洗膜后加入二抗，室溫孵育1 h，經(jīng)TBST洗膜后加入ECL試劑盒A、B混合液(1∶1)，然后曝光、顯影、定影，掃描膠片，用軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)觀察

正常組的大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)靈敏，毛發(fā)有光澤，體質(zhì)量明顯增加。模型組的大鼠精神亢奮，易激惹，毛發(fā)干枯、無(wú)光澤，飲水量明顯增加，消瘦。西藥組和各中藥組的大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況與模型組相比有所改觀。

3.2 體質(zhì)量變化

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠體質(zhì)量增量有非常顯著性差異(P<0.01)，和正常組相比，模型組體質(zhì)量增量非常顯著性降低(P<0.01)；和模型組相比，西藥組、酸棗仁湯組、合方組非常顯著性升高(P<0.01)；和西藥組相比，酸棗仁湯組、合方組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果表明酸棗仁湯組、合方組均可增加大鼠的體質(zhì)量，見表1。

表1 大鼠體質(zhì)量增量變化

注：與正常組相比，##P<0.01;與模型組相比，**P<0.01

3.3 失眠大鼠海馬腦組織中GABAARα1mRNA、GABAARγ2 mRNA和NKCC1 mRNA的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示：各組大鼠GABAARα1mRNA的表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)，和正常組相比，模型組表達(dá)顯著性下降(P<0.05)；和模型組相比，西藥組、酸棗仁湯組表達(dá)顯著性上升(P<0.05)，合方組GABAARα1mRNA表達(dá)非常顯著性上升(P<0.01)；和西藥組相比，酸棗仁湯組、合方組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各組大鼠GABAARγ2mRNA的表達(dá)沒有顯著性差異(P>0.05)，但模型組表達(dá)顯示出明顯降低趨勢(shì)，且各用藥組都有提高其表達(dá)的趨勢(shì)。各組大鼠NKCC1mRNA的表達(dá)沒有顯著性差異(P>0.05)，但模型組表達(dá)顯示出明顯升高趨勢(shì)，且各用藥組都有降低其表達(dá)的趨勢(shì)，見表2。

表2 大鼠海馬GABAARα1mRNA、GABAARγ2mRNA、NKCC1mRNA表達(dá)變化

注：與正常組相比，#P<0.05;與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

3.4 失眠大鼠海馬腦組織中GABAARα1、GABAARγ2和NKCC1蛋白的表達(dá)

Western Blot結(jié)果顯示：各組大鼠GABAARα1有非常顯著性差異(P<0.01)，和正常組相比，模型組表達(dá)非常顯著性下降(P<0.01)；和模型組相比，西藥組顯著性升高(P<0.05)，酸棗仁湯組、合方組非常顯著性升高(P<0.01)；和西藥組相比，四逆散組、酸棗仁湯組、合方組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各組大鼠GABAARγ2有非常顯著性差異(P<0.01)，和正常組相比，模型組表達(dá)非常顯著性下降(P<0.01)；和模型組相比，西藥組、四逆散組顯著性升高(P<0.05)，合方組非常顯著性升高(P<0.01)；和西藥組相比，四逆散組、酸棗仁湯組、合方組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。各組大鼠NKCC1有非常顯著性差異(P<0.01)，和正常組相比，模型組表達(dá)非常顯著性上升(P<0.01)；和模型組相比，西藥組、四逆散組、酸棗仁湯組、合方組非常顯著性下降(P<0.01)；和西藥組相比，四逆散組、合方組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見表3，電泳圖見圖1。

表3 大鼠海馬GABAARα1、GABAARγ2、NKCC1蛋白的表達(dá)變化

注：與正常組相比，#P<0.05，##P<0.01;與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

失眠是臨床上一種常見的疾病，由于現(xiàn)在的時(shí)代特點(diǎn)和人們不規(guī)律的生活方式，失眠的人數(shù)也越來(lái)越多。有關(guān)失眠的發(fā)生機(jī)制，有兩種比較公認(rèn)的假說(shuō)，一種是神經(jīng)生物學(xué)層面的“過(guò)度覺醒假說(shuō)”[7]，另一種是認(rèn)知行為學(xué)方面的“3P假說(shuō)”[8-9]。而這兩種機(jī)制的發(fā)生和海馬腦組織中的GABA能神經(jīng)系統(tǒng)有一定的關(guān)系，GABA是腦中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，一直被認(rèn)為和睡眠密切相關(guān)，它通過(guò)和GABAA受體結(jié)合而發(fā)揮抑制性神經(jīng)保護(hù)作用。GABAA受體是由2個(gè)α、2個(gè)β和1個(gè)γ組成的五聚體大分子[10]，在這些受體中， GABAARα1和GABAARγ2是數(shù)量最多的受體，也是反應(yīng)睡眠的最重要的功能基團(tuán)，這些受體上的門控氯離子通道蛋白開放導(dǎo)致Cl-內(nèi)流或者外流，從而發(fā)生抑制或者興奮作用。在成熟的神經(jīng)細(xì)胞中，胞膜內(nèi)Cl-的濃度受到NKCC1的影響，若NKCC1表達(dá)量升高時(shí)，胞內(nèi)出現(xiàn)高Cl-狀態(tài)，當(dāng)GABAA受體被激活，Cl-通道開放，Cl-外流，胞膜去極化，產(chǎn)生神經(jīng)興奮性作用；若NKCC1表達(dá)量下降時(shí)，胞內(nèi)出現(xiàn)低Cl-狀態(tài)，當(dāng)GABAA受體被激活，Cl-通道開放，Cl-以內(nèi)流，胞膜超極化，產(chǎn)生神經(jīng)抑制性作用[11]。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，失眠通過(guò)不同強(qiáng)度的電針刺激能夠上調(diào)GABAARα1的表達(dá)而起到治療作用。也有研究發(fā)現(xiàn)酸棗仁-五味子藥對(duì)醇水雙提物能夠提高GABAARα1和GABAARγ2的表達(dá)而達(dá)到失眠的治療效果[13]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取GABAARα1、GABAARγ2和NKCC1作為反應(yīng)失眠機(jī)制的觀察指標(biāo)。

圖1 各組大鼠海馬GABAARα1、GABAARγ2、NKCC1蛋白的表達(dá)注：A.正常組;B.模型組;C.西藥組;D.四逆散組;E.酸棗仁湯組;F.合方組

失眠中醫(yī)又稱為“不寐”“不得眠”“臥不安”等，中醫(yī)認(rèn)為失眠的病位在心，但是睡眠的發(fā)生也依賴于肝的正常生理功能，肝主疏泄和藏血功能正常，則人臥魂歸于肝，神志安靜，睡眠安穩(wěn)；若由于各種情志因素導(dǎo)致肝的疏泄和藏血功能異常，就會(huì)出現(xiàn)失眠，正如《普濟(jì)本事方·獨(dú)活湯》云：“平人肝不受邪，故臥則魂歸于肝，神靜而得寐。今肝有邪，魂不得歸，是以臥則魂揚(yáng)若離體也。”治療上我們選用四逆散和酸棗仁湯合方，二方出自《金匱要略》，是疏肝氣、養(yǎng)肝血的經(jīng)典方劑，二方合用可以恢復(fù)肝的正常生理功能，使睡眠正常。

本次實(shí)驗(yàn)中通過(guò)觀察各組大鼠的一般狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)正常組的大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)靈敏，毛發(fā)有光澤，體質(zhì)量明顯增加。模型組的大鼠精神亢奮，易激惹，毛發(fā)干枯、無(wú)光澤，飲水量明顯增加，消瘦。西藥組和各中藥組的大鼠精神狀態(tài)和活動(dòng)情況和模型組相比有所改善，體質(zhì)量增量也有所增加。

Western Blot的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：失眠大鼠和正常大鼠相比，海馬中GABAARα1和GABAARγ2的表達(dá)明顯降低，經(jīng)過(guò)西藥和各中藥治療，西藥、合方能夠有效升高失眠大鼠海馬中GABAARα1和GABAARγ2的表達(dá)量，而四逆散能有效升高大鼠海馬中GABAARγ2表達(dá)量，酸棗仁湯能夠有效升高大鼠海馬中GABAARα1的表達(dá)量。NKCC1的結(jié)果顯示：失眠大鼠和正常大鼠相比，海馬中NKCC1的表達(dá)明顯升高，經(jīng)過(guò)西藥和各中藥治療，都能夠有效降低大鼠海馬中NKCC1的表達(dá)量，并且四逆散、合方和西藥治療效果無(wú)差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示：失眠大鼠和正常大鼠相比，GABAARα1mRNA表達(dá)明顯下降，西藥、酸棗仁湯、合方能夠有效提高GABAARα1mRNA的表達(dá)，酸棗仁湯、合方和西藥效果無(wú)差異；各組大鼠海馬中的GABAARγ2mRNA和NKCC1mRNA表達(dá)雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是模型組GABAARγ2mRNA的表達(dá)有明顯下降趨勢(shì)，NKCC1mRNA表達(dá)有明顯上升趨勢(shì)，且各用藥組都有升高GABAARγ2mRNA、降低NKCC1mRNA表達(dá)的趨勢(shì)。兩種實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，失眠大鼠海馬中GABAARα1和GABAARγ2的蛋白和mRNA表達(dá)都降低，而NKCC1的蛋白和mRNA升高，經(jīng)過(guò)藥物治療，西藥和各組中藥能夠有效地升高GABAARα1和GABAARγ2蛋白和mRNA的表達(dá)，同時(shí)降低NKCC1蛋白和mRNA的表達(dá)，從而起到治療作用，并且合方組治療效果更全面。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察到，四逆酸棗仁湯合方能夠有效地改善失眠大鼠的睡眠節(jié)律，并且可能是通過(guò)上調(diào)大鼠海馬中GABAARα1和GABAARγ2，降低NKCC1而發(fā)揮治療作用。

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