維藥布亞中金雀花堿誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡作用及其衍生物的制備

于蕾，尚東雨，楊經(jīng)輝，陳志峰，王鑫，姜波，孫永雪，張連芳，季宇彬(.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心，黑龍江 哈爾濱 50076；2.國家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱 50076)

維藥布亞(SophoraalopecuroidesL.)屬于豆科槐屬植物，又稱苦豆子，全株具有味苦性寒的特點(diǎn)，發(fā)揮清熱消暑、利尿除濕、抗菌消炎、止痛鎮(zhèn)靜等作用，在臨床上能有效治療濕熱痢疾，喉痛、咳嗽，腸炎泄瀉及濕疹等濕熱性或血液質(zhì)性疾病[1]。維藥布亞中含有豐富的生物堿類成分，其中金雀花堿(Cytisine)又被稱為金雀花酮堿、野靛堿以及烏樂堿，屬于喹諾里西啶類生物堿[2]。維藥布亞中的生物堿歸屬于喹諾里西啶類生物堿，這類生物堿具有相似的結(jié)構(gòu)和功能，野決明屬和紫藤屬等這些不同屬的植物中也含有此類生物堿[3]。20世紀(jì)60年代初，人類就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)此類生物堿具有抑瘤作用，其中維藥布亞總堿、苦參堿和槐定堿早已用于臨床治療惡性腫瘤，槐定堿是Ⅰ類抗癌新藥[4]，而結(jié)構(gòu)相似的金雀花堿抗癌效果在最進(jìn)研究中才初見端倪。

天然抗腫瘤藥物以其作用機(jī)制獨(dú)特、毒副作用低的特點(diǎn)一直是近年來抗腫瘤藥物研究的一個(gè)熱點(diǎn)，通過對(duì)天然藥物進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾可以提高藥物作用強(qiáng)度、提高藥物特異性或降低藥物毒副作用，或優(yōu)化其物理化學(xué)活性[5]。Rouden J[6]等人對(duì)金雀花堿進(jìn)行化學(xué)修飾反應(yīng)得到了一系列的9-及10-取代金雀花堿衍生物，對(duì)其進(jìn)行親和力分析實(shí)驗(yàn)，結(jié)果，兩個(gè)10-取代衍生物在與α4β2膽堿受體亞型的結(jié)合試驗(yàn)中具有比金雀花堿更高的選擇性，分別是金雀花堿的3000倍及900倍。合成的9-乙烯基金雀花堿與金雀花堿的生物活性非常相似，同時(shí)還可以穿透血腦屏障，提高了金雀花堿的生物活性及利用價(jià)值。Houllier N[7]等人合成了一系列新的N-(芳烷基)和N-(芳?；?-金雀花堿，對(duì)其進(jìn)行大鼠α4β2和α7膽堿受體亞型結(jié)合的實(shí)驗(yàn)研究，結(jié)果表明多數(shù)修飾后的衍生物對(duì)α4β2膽堿受體亞型具有高親和性。其中的3個(gè)衍生物的鈣離子活性及電生理實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這三個(gè)衍生物對(duì)不同的亞型表現(xiàn)出拮抗劑或部分激動(dòng)劑活性，表明N取代基的金雀花堿衍生物對(duì)其活性有很大的影響。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)金雀花堿進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，試圖提高金雀花堿的生物活性及利用價(jià)值，減小藥物副作用，為獲得更佳的抗腫瘤衍生物進(jìn)了初步的研究。

本實(shí)驗(yàn)首先通過MTT法對(duì)金雀花堿進(jìn)行體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其具有明顯抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖的活性。在此研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對(duì)金雀花堿作用后HepG-2細(xì)胞形態(tài)及其超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，確定其是否對(duì)細(xì)胞生長狀態(tài)及細(xì)胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)還應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)金雀花堿作用后HepG-2細(xì)胞凋亡率。此外，本實(shí)驗(yàn)采用親核取代的方法對(duì)活潑氫進(jìn)行取代，得到金雀花堿衍生物N-乙?；鹑富▔A，并采用MTT法檢測(cè)N-乙酰基金雀花堿對(duì)HepG-2細(xì)胞的增殖抑制作用并與金雀花堿進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌HepG-2細(xì)胞，由哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心提供。HepG-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物及試劑

金雀花堿(純度>98%，批號(hào)：20111101C)，陜西大河藥業(yè)有限責(zé)任公司；羥基喜樹堿(HCPT，純度>98%，批號(hào)：H109197)，阿拉丁試劑有限公司；胰蛋白酶(批號(hào)：20130308)，美國Sigma藥物公司；二甲基亞砜(DMSO)(批號(hào)：20120726)，天津巴斯夫化工有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基(批號(hào)：20130507)，GIBCO公司；胎牛血清(批號(hào)：20130206)，杭州四季青生物工程公司；MTT(溴化四氮唑藍(lán))(批號(hào)：2010212)，北京索萊寶科技有限公司；碘化丙啶(PI)(批號(hào)：P4170)，Sigma公司；RNase A(批號(hào)：V900498)，Sigma公司；Triton-X-100(批號(hào)：V900502)，上海華舜生物工程有限公司；枸櫞酸鈉(分析純，批號(hào)：20120625)，北京康普匯維科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

ZF-C型三用紫外分光儀，上?？岛坦怆妰x器有限公司；ADVANCE III 600MHz高分辨核磁共振波譜儀，Bruker公司；Olympus-CKI41倒置顯微鏡，日本Olympus公司；680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD公司；JEM-1220透射電子顯微鏡，日本電子公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測(cè)金雀花堿對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的生長抑制作用

細(xì)胞生長抑制率=( A對(duì)照組- A試驗(yàn)組)/ A對(duì)照組×100%。

1.2.2 倒置顯微鏡觀察金雀花堿作用后HepG-2的細(xì)胞形態(tài)

胰酶消化后稀釋為濃度為3×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，每孔1 mL接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后，每孔加1 mL不同濃度的藥液，金雀花堿實(shí)驗(yàn)組的濃度分別為2.5、5、10 mmol/L，陽性藥HCPT的濃度為60 μmol/L，空白對(duì)照組每孔加1 mL 的RPMI1640培養(yǎng)液，藥物作用48 h后，在倒置顯微鏡下拍照觀察其形態(tài)變化[10-11]。

1.2.3 透射電子顯微鏡觀察金雀花堿對(duì)HepG-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

取對(duì)數(shù)生長期的HepG-2細(xì)胞，胰酶消化后，以3×105個(gè)/mL接種于6孔板，24 h后給藥，每個(gè)濃度3個(gè)平行組，金雀花堿的給藥濃度分別為2.5、5、10 mmol/L，陽性藥HCPT的濃度為60 μmol/L，空白對(duì)照組加等體積的RPMI 1640培養(yǎng)液，作用24 h后，收集細(xì)胞，立即用2%戊二醛固定2.5 h，再用鋨酸進(jìn)行雙重固定。經(jīng)乙醇梯度脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色后，透射電鏡下觀察并拍照[12]。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)金雀花堿對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡率的影響

對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，稀釋終濃度為3×105個(gè)/mL，接種于6孔板，培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，每孔加1 mL不同濃度的藥液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，金雀花堿給藥組的濃度(2.5、5、10 mmol/L)，陽性藥HCPT的濃度為60 μmol/L，空白對(duì)照組加1 mL的RPMI1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h后取出6孔培養(yǎng)板，每孔加入1 mL PBS緩沖液洗3次，1 mL 0.25 %胰蛋白酶消化，懸液移至離心管，1000 rpm、10 min離心收集細(xì)胞，PBS重懸并計(jì)數(shù)，取1×106個(gè)重懸的細(xì)胞，于4℃冰箱內(nèi)固定液固定24 h，1000 rpm離心棄固定液，用PBS洗3次，避光條件下加PI染色液(避光條件下稱取枸櫞酸鈉33.4 mg，PI 5 mg，RnaseA 1 mg，加入Trtiton-X-100 0.5 mL，充分混勻)800 μL，混勻，孵育30 min；400目尼龍網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry, FCM)檢測(cè)[13-14]。

1.2.5 目標(biāo)化合物的設(shè)計(jì)與合成及產(chǎn)物對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的生長抑制作用

圖1為金雀花堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式圖，3位上的N原子連接的H是活潑氫，所以容易被其他物質(zhì)取代，本實(shí)驗(yàn)在此理論基礎(chǔ)下，用Ac2O對(duì)其進(jìn)行親核取代反應(yīng)。目標(biāo)化合物的合成路線如圖2。室溫、攪拌條件下，向前體化合物金雀花堿(95 mg，0.5 mmol)和乙酸酐(2.0 mL)混合溶液中，加入吡啶(2 mL,0.002 5 mmol)，反應(yīng)24 h，待TLC檢測(cè)底物金雀花堿消失，攪拌下將反應(yīng)混合物倒入冰鹽水(50 mL)中，真空抽濾得到白色固體，TLC檢測(cè)所得固體為單一化合物，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1H-NMR檢測(cè)。此外，采用MTT法檢測(cè)金雀花堿衍生物對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的生長抑制作用，實(shí)驗(yàn)方法及給藥劑量同1.2.1。

圖1 金雀花堿化學(xué)結(jié)構(gòu)式

圖2 金雀花堿衍生物合成路線

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)金雀花堿對(duì)人肝癌HepG-2細(xì)胞的生長抑制作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3。金雀花堿作用于HepG-2細(xì)胞72 h后，隨著藥物濃度的增加，OD值顯著降低，HepG-2細(xì)胞的生長抑制率逐漸升高。經(jīng)計(jì)算金雀花堿IC50為5.36 mmol/L。陽性藥HCPT對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用顯著，72 h的半數(shù)抑制濃度IC50為8.56 μmol/L。

圖3 金雀花堿作用后HepG-2細(xì)胞的生長抑制率

2.2 倒置顯微鏡觀察金雀花堿作用后HepG-2的細(xì)胞形態(tài)

如圖4所示，細(xì)胞給藥48 h后，在普通倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組細(xì)胞會(huì)貼壁聚堆生長，細(xì)胞飽滿，邊緣清晰，無漂浮死細(xì)胞。HCPT對(duì)照組漂浮死細(xì)胞較金雀花堿中劑量組少，細(xì)胞存在明顯的形態(tài)學(xué)變化。隨著金雀花堿劑量的增加細(xì)胞體積逐漸變小，細(xì)胞逐漸變圓變粗糙，折光性逐漸減弱，貼壁細(xì)胞減少，出現(xiàn)懸浮死細(xì)胞。中高劑量組細(xì)胞多數(shù)脫落，有少數(shù)細(xì)胞體積變大，細(xì)胞破裂，呈壞死狀。

圖4 倒置顯微鏡觀察HepG-2的細(xì)胞形態(tài)(10×40)注：A.空白對(duì)照組；B.陽性對(duì)照組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組

2.3 金雀花堿對(duì)HepG-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

金雀花堿對(duì)HepG-2細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響如圖5所示，空白對(duì)照組細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞表面少量微絨毛突起，細(xì)胞核較大，常染色質(zhì)豐富，核仁明顯，胞漿呈均勻中等的電子密度，具有較多游離多聚核糖體，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體散在分布于細(xì)胞中。不同濃度金雀花堿作用后可見細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞表面微絨毛減少和消失，凋亡細(xì)胞可見大小不等球狀的突起及凋亡小體，細(xì)胞膜破裂，胞漿外溢；高劑量組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔明顯擴(kuò)張、線粒體腫脹。陽性對(duì)照組線粒體減少，細(xì)胞突起明顯減少，可見大面積內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹擴(kuò)張可見典型凋亡細(xì)胞、凋亡小體。表明金雀花堿能損傷重要細(xì)胞器誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡。

圖5 金雀花堿作用HepG-2細(xì)胞后的電鏡圖片(8000×)注：A.空白對(duì)照組；B.陽性對(duì)照組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)金雀花堿對(duì)HepG-2細(xì)胞凋亡率的影響

不同濃度的金雀花堿作用于人肝癌HepG-2細(xì)胞48 h后，F(xiàn)CM檢測(cè)結(jié)果如表1和圖6顯示，金雀花堿給藥組的DNA直方圖中G0/G1峰前面出現(xiàn)明顯的亞二倍體凋亡峰，且隨著金雀花堿濃度的增加凋亡率也有顯著增加(P<0.01)。金雀花堿的給藥量為2.5 mmol/L時(shí)凋亡率為(3.72±0.49)%，隨著給藥量上升到10 mmol/L時(shí)，凋亡率上升至(65.74±3.34)%，呈一定的劑量依賴性。陽性組凋亡率為(15.83±3.16)%(P<0.01)。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)金雀花堿對(duì)HepG-2細(xì)胞的凋亡率

注：與空白組比較，**P<0.01

圖6 FCM檢測(cè)HepG-2細(xì)胞凋亡率注：A.空白對(duì)照組；B.陽性對(duì)照組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組

2.5 金雀花堿衍生物結(jié)構(gòu)鑒定

將得到的產(chǎn)物點(diǎn)樣展開，TLC檢測(cè)，呈現(xiàn)藍(lán)紫色熒光的單一化合物，與反應(yīng)物金雀花堿存在極性差異，表明原料金雀花堿完全反應(yīng)得到產(chǎn)物。NMR檢測(cè)：白色固體，1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 1.75 (s, 2H), 1.98～2.02 (m, 3H), 2.53 (s, 1H), 2.83(q, J=2.0, 1H), 3.09(s, 1H), 3.40 (q, J=1.5 Hz, 1H), 3.84～3.92 (m, 2H), 4.12 (q, J=2.0 Hz, 1H),4.74(dd, J=4.5 ,6.0Hz, 1H), 6.07(q, J=2.0 Hz, 1H), 6.46(q, J=1.5 Hz, 1H),7.30(s, 1H)。結(jié)果表明，產(chǎn)物為白色固體，與文獻(xiàn)[15]比對(duì)一致，故鑒定該化合物為N-乙酰基金雀花堿(N-acetylcytisine)。

2.6 MTT法檢測(cè)N-乙酰基金雀花堿對(duì)HepG-2細(xì)胞的生長抑制作用

MTT法檢測(cè)不同濃度金雀花堿及N-乙?；鹑富▔A對(duì)HepG-2細(xì)胞的生長抑制作用，經(jīng)過3次平行實(shí)驗(yàn)求出半數(shù)抑制濃度。由表2可明顯看出，N-乙?；鹑富▔A作用于HepG-2細(xì)胞72 h后，隨著藥物濃度的增加，OD值顯著降低，HepG-2細(xì)胞的生長抑制率逐漸升高。經(jīng)計(jì)算金雀花堿IC50為5.51 mmol·L，N-乙酰基金雀花堿IC50為7.51 mmol/L。陽性藥HCPT對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用顯著，72 h的半數(shù)抑制濃度IC50為8.56 μmol/L。

3 討論

維藥布亞(SophoraAlopecuraidesL.)是豆科槐屬(Sophora)植物，主要分布在我國西北的荒漠地區(qū)和中亞細(xì)亞一帶地區(qū)[16]。布亞全株具有味苦性寒的特點(diǎn)，發(fā)揮止痛鎮(zhèn)靜、清熱消暑、抗菌消炎、利尿除濕等作用，在臨床上能有效治療喉痛、濕熱痢疾、咳嗽、腸炎泄瀉及濕疹等濕熱性或血液質(zhì)性疾病[17]。布亞含有多種化學(xué)成分，包含了有機(jī)酸、蛋白質(zhì)、多糖、黃酮和生物堿等，其中生物堿含量最高，地上部分的生物堿含量占總生物堿的6.11%～8.03%，種子中的生物堿含量高達(dá)8.11%。布亞生物堿具有鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、降壓降脂、抗病毒、抗炎以及抗腫瘤作用，是布亞的主要生物活性成分[18]。

表2 MTT法測(cè)定金雀花堿及N-乙酰基金雀花堿對(duì)HepG-2的抑制率

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01

喹諾里西啶類生物堿的多種生物學(xué)活性得到了廣泛研究，其中包括槐定堿、苦參堿、苦豆堿在內(nèi)的生物堿被證明具有良好的抗腫瘤活性，而關(guān)于金雀花堿該方面的研究卻少有報(bào)道[19-20]。本實(shí)驗(yàn)首先通過體外實(shí)驗(yàn)的方法，從增殖抑制作用、形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞凋亡率等方面對(duì)金雀花堿的抗腫瘤作用進(jìn)行研究。MTT法是一種常用的體外篩選抗腫瘤藥物的方法，操作簡便、敏感。活細(xì)胞線粒體中的脫氫酶可以把MTT代謝還原形成一種藍(lán)紫色不溶物-甲瓚化合物(Formazan)，通過該原理測(cè)定不同給藥劑組顏色變化的深淺，得到腫瘤細(xì)胞生長狀況。通過計(jì)算測(cè)定的OD值得可到細(xì)胞受抑制的情況[21]。本研究發(fā)現(xiàn)金雀花堿能顯著抑制人肝癌HepG-2細(xì)胞增殖，IC50為5.36 mmol/L。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)形態(tài)學(xué)的概念，發(fā)生凋亡的細(xì)胞有著典型的形態(tài)學(xué)特征[22]。采用倒置顯微鏡觀察給金雀花堿48 h后HepG-2細(xì)胞的形態(tài)變化?？瞻捉M細(xì)胞會(huì)貼壁聚堆生長，細(xì)胞飽滿，邊緣清晰，無漂浮死細(xì)胞，金雀花堿給藥組細(xì)胞隨著劑量的增加細(xì)胞體積逐漸變小，細(xì)胞逐漸變圓變粗糙，折光性逐漸減弱，貼壁細(xì)胞減少，出現(xiàn)懸浮死細(xì)胞，中高劑量組細(xì)胞多數(shù)脫落，有少數(shù)細(xì)胞體積變大，細(xì)胞破裂，呈壞死狀。此外，本實(shí)驗(yàn)還采用透射電鏡進(jìn)一步分析金雀花堿引起的HepG-2 細(xì)胞凋亡形態(tài)變化，結(jié)果顯示，不同濃度金雀花堿作用后可見HepG-2 細(xì)胞凋亡發(fā)生形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞表面的微絨毛減少或有些消失，凋亡細(xì)胞出現(xiàn)大小不等球狀的突起和凋亡小體，細(xì)胞膜被破裂，導(dǎo)致胞漿外溢；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔擴(kuò)張明顯,線粒體腫大。倒置顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察結(jié)果都為證明金雀花堿能誘導(dǎo)HepG-2凋亡提供了形態(tài)學(xué)的依據(jù)。

對(duì)PI染色后的細(xì)胞進(jìn)行FCM分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的G0/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體凋亡峰(apoptotic peak，AP峰)，代表凋亡細(xì)胞。根據(jù)此峰可以得出凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分率[23-25]。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示給藥組出現(xiàn)明顯凋亡峰，且呈一定的劑量依賴性，高劑量組凋亡率為(65.74±3.34)%，明確了金雀花堿能誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞的凋亡。通過對(duì)金雀花堿作用后細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔明顯擴(kuò)張、線粒體出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，說明金雀花堿誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞凋亡，可能是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及線粒體通路進(jìn)行的。

研究顯示，多數(shù)N取代基的金雀花堿衍生物對(duì)其生物活性有很大的影響[7]。為提高金雀花堿的生物活性及利用價(jià)值，獲得活性更好，毒副作用更低的抗腫瘤金雀花堿衍生物，本實(shí)驗(yàn)對(duì)金雀花堿進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾。本實(shí)驗(yàn)分析得出目標(biāo)化合物N-乙酰基金雀花堿，但MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)計(jì)算金雀花堿IC50為5.51 mmol/L，N-乙?；鹑富▔AIC50為7.51 mmol/L，提示其衍生物活性低于金雀花堿本身，并未能增強(qiáng)其抗腫瘤活性，說明金雀花堿的此種衍生物，不能起到增強(qiáng)藥效的作用，不再具備繼續(xù)研究的潛質(zhì)。

綜上所述，金雀花堿體外具有抑制HepG-2細(xì)胞生長的作用，能夠誘導(dǎo)人肝癌HepG-2細(xì)胞凋亡。N-乙?；鹑富▔A能夠抑制HepG-2細(xì)胞的生長，但其作用較金雀花堿弱，表明在金雀花堿的3位N上修飾鏈狀結(jié)構(gòu)Ac2O并不能增強(qiáng)金雀花堿的抗腫瘤活性。

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