低溫脅迫對小葉樸離體葉片生理生化指標(biāo)的影響

姜子穎 李存華 王志 吳曉宇 呂昆侖 張東

摘 要：選取1年生小葉樸營養(yǎng)枝的離體葉片為材料，對其進行不同低溫（5，0，-5，-10，-15，-20 ℃）脅迫處理，分別測定葉片中的超氧化物歧化酶（SOD）活性和相對電導(dǎo)率，以及丙二醛（MDA）、可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量，研究小葉樸葉片的抗寒性。結(jié)果表明，隨著脅迫溫度的降低，小葉樸離體葉片SOD活性表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，至-10 ℃達到最高值；相對電導(dǎo)率和MDA含量表現(xiàn)出一直升高的趨勢；可溶性蛋白含量表現(xiàn)出一直降低的趨勢；脯氨酸和可溶性糖含量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，亦至-10 ℃達到最高值。綜合說明，低溫脅迫使小葉樸葉片細胞膜受到傷害，在高于-10 ℃可通過提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護酶活性提高低溫抗性，但在低于-10 ℃，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護酶活性亦降低。

關(guān)鍵詞：低溫脅迫；小葉樸；生理指標(biāo)

中圖分類號：S792.99 文獻標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.05.005

Abstract： The experiment was conducted to study the influence of low temperature on Celtis bungeana with the excised leaves of annual vegetative branches . Six low temperature treatments were set， including 5， 0， -5， -10， -15， -20 ℃， the superoxide dismutase （SOD）， electrical conductivity， and also the content of malondialdehyde （MDA）， soluble protein， proline， and soluble sugar were measured after 10 days under treatments. The results showed that： with the decreasing of temperature， SOD of C. bungeana excised leaves increased and then decreased， the maximum was at -10 ℃； the relative conductivity and MDA content were increased continuously， soluble protein content showed a decreasing trend； soluble sugar and proline content increased and then decreased， the maximum were both at -10 ℃. In conclusion， under low temperature stress， C. bungeana leaf membrane was injured， and C. bungeana leaf could increase the cold resistance through promoting the osmotic adjustment substances content and protective enzyme activity when the temperature was higher than -10 ℃， but the osmotic adjustment substances content and protective enzyme activity were decreased when the temperature was lower than -10 ℃.

Key words： low temperature stress； Celtis bungeana； physiological index

小葉樸（Celtis bungeana）屬于榆科樸屬落葉喬木，該樹葉大、質(zhì)厚、色濃綠，樹形端正，樹冠整齊[1]。其具有很強的抗有毒氣體能力，耐粉塵和煙塵；加上該樹具有優(yōu)良的種質(zhì)資源[2]，可作行道樹和學(xué)校、醫(yī)院、居民區(qū)、廠區(qū)綠化樹種，也可以利用其鄉(xiāng)土樹種的優(yōu)勢，進行荒山造林[1]。真樹皮纖維可代麻用或作造紙和人造棉原料；木材供建筑用、樹干可藥用，主治支氣管哮喘及慢性氣管炎。由此可見，小葉樸具有較高的生態(tài)和經(jīng)濟價值。

在低溫脅迫下，植物生理生化指標(biāo)會發(fā)生變化，主要包括細胞膜相對透性、酶活性，以及脯氨酸和可溶性糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等與其抗逆性密切相關(guān)的指標(biāo)[3-5]。但目前，有關(guān)小葉樸抗寒性、低溫脅迫對小葉樸離體葉片生理生化指標(biāo)影響的研究，國內(nèi)未見相關(guān)報道。

本試驗研究不同低溫脅迫下，小葉樸離體葉片生理生化指標(biāo)的變化情況，旨在為小葉樸的推廣、引種和栽培提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料取自小葉樸1年生實生苗，將幼苗置于濟南長清苗圃自然生長一段時間后，隨機采集長勢相同的葉片若干，取樣后混合，置于自封袋中迅速帶回山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院實驗室進行處理，依次用自來水、去離子水清洗干凈，濾紙吸干表面水分，用于后續(xù)試驗的開展。

1.2 試驗設(shè)計

清洗處理后的葉片用錫箔紙包起來，即刻放入冰箱中進行不同溫度的冷凍處理。試驗設(shè)置5，0，-5，-10，-15，-20 ℃共6個低溫處理，每個處理3個重復(fù)。不同的溫度處理24 h后取出樣品置于2 ℃解凍2 h，再置于常溫下放置12 h，然后稱取各處理樣葉0.5 g，分別用于電導(dǎo)率、可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛含量及SOD活性的測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

膜質(zhì)透性測定采用電導(dǎo)率法[6]，SOD活性測定采用氯化硝基四氮唑藍（NBT）光化還原法，脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法[7]，丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法[6]，可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法[8]，可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍法[9]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2003進行原始數(shù)據(jù)整理，及圖表與工作曲線的繪制，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對小葉樸離體葉片超氧化物岐化酶（SOD）活性的影響

SOD是一種存在于生命體內(nèi)的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。在正常條件下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于平衡狀態(tài)，當(dāng)受到寒害時，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生能力超過清除能力，活性氧會在體內(nèi)大量積累，并繼而對細胞組分造成一定的損傷[10]。由圖1和表1可知，小葉樸葉片SOD活性隨著溫度的降低，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，當(dāng)溫度從5 ℃降到-10 ℃時，SOD活性顯著上升并在-10 ℃時達到最大值，而在-10 ℃至-20 ℃，SOD活性急劇下降，隨溫度繼續(xù)降低SOD活性升高趨勢進一步增大，當(dāng)降到-10 ℃時達到最大值，此時SOD酶對細胞膜有一定的保護作用；之后隨著溫度的繼續(xù)降低，SOD 活性逐漸下降，可能是因為溫度的降低，超過了小葉樸自身的耐受水平，細胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受到損害。

2.2 低溫脅迫對小葉樸離體葉片細胞膜透性的影響

2.2.1 低溫脅迫對小葉樸離體葉片相對電導(dǎo)率的影響 由圖2和表2可知，隨著脅迫溫度的降低，小葉樸葉片相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，其中，5 ℃和0 ℃處理之間差異不顯著；-5 ℃時，相對電導(dǎo)率的上升幅度比較小，說明此時小葉樸細胞膜系統(tǒng)受到的傷害比較??；由0 ℃至-10 ℃，相對電導(dǎo)率顯著升高；在-10 ℃和-15 ℃處理之間差異不顯著；隨著脅迫溫度的繼續(xù)降低，相對電導(dǎo)率逐步大幅度上升，到至-20 ℃時達到最高水平，顯著高于其他處理，此時細胞膜系統(tǒng)已受到嚴(yán)重傷害，電解質(zhì)大量外滲。

2.2.2 低溫脅迫對小葉樸離體葉片丙二醛（MDA）含量的影響 丙二醛是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，能直接反映膜受損害程度[10]。由圖3和表2可知，隨著脅迫溫度的降低，小葉樸葉片MDA含量呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，在5～-5 ℃，MDA含量緩慢上升，處理間差異未達顯著水平，之后上升幅度變大，在-5 ℃MDA含量顯著低于-10 ℃和-15 ℃，后二者差異不顯著，至-20 ℃時，MDA含量上升趨勢加大最大，顯著高于其他各處理。由此可見，MDA含量變化趨勢與相對電導(dǎo)率大體一致。MDA含量大幅度增加，表明細胞膜脂過氧化加劇，細胞膜受到了嚴(yán)重的損害和破壞。

2.3 低溫脅迫對小葉樸離體葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

2.3.1 低溫脅迫對小葉樸離體葉片可溶性蛋白含量的影響 植物體內(nèi)的可溶性蛋白很大一部分是可以參與很多代謝的酶類，是衡量植物體內(nèi)代謝強弱的一個重要指標(biāo)，其含量與抗寒性呈正相關(guān)[10]。從圖4和表3可以看出，隨著溫度的降低，小葉樸葉片可溶性蛋白含量呈逐漸下降的趨勢， 其中5 ℃顯著高于其他溫度處理，在0 ℃和-5 ℃之間差異不顯著，可溶性蛋白含量變化比較穩(wěn)定，呈小幅度的下降趨勢；當(dāng)溫度達到-10 ℃和 -15 ℃，后二者之間差異不顯著，可溶性蛋白含量大幅度下降；溫度達到至-20 ℃時，可溶性蛋白含量最低，顯著低于其他處理組。可能是由于在較低溫度的脅迫下，小葉樸葉片可溶性蛋白分解加速，分解為各種氨基酸，葉片滲透勢降低，滲透調(diào)節(jié)能力加強。

2.3.2 低溫脅迫對小葉樸離體葉片脯氨酸含量的影響 脯氨酸是植物蛋白質(zhì)的組分之一，在寒冷、干旱等脅迫條件下，脯氨酸會大量積累，可作為植物細胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[10]。從圖5 和表3可以看出，隨著脅迫溫度的降低，小葉樸葉片脯氨酸含量呈先升高后降低的變化趨勢，在5～-10℃，脯氨酸含量顯著增加，至當(dāng)溫度達到0 ℃時，脯氨酸含量較5 ℃時有小幅度的上升；當(dāng)脅迫溫度達到-5 ℃時，脯氨酸含量大幅度上升；脯氨酸含量在-10 ℃時達到最大值，之后又顯著降低?？赡苁且驗榍捌谥参飳Φ蜏丨h(huán)境的一種自身調(diào)節(jié)能力，通過積累脯氨酸的含量來提高其抗寒能力；隨后脯氨酸含量呈下降趨勢，可能是由于過低的脅迫溫度超過了小葉樸的承受能力。

2.3.3 低溫脅迫對小葉樸離體葉片可溶性糖含量的影響 從圖6和表3可以看出，隨脅迫溫度的降低，小葉樸葉片可溶性糖含量呈先升高后降低的變化趨勢，在5～-5 ℃，可溶性糖含量緩慢增加，處理間差異不顯著，至-10 ℃可溶性糖含量顯著增加至最高值，之后顯著下降?？赡苁且驗樵谟龅降蜏卮碳ず螽a(chǎn)生的一種保護性應(yīng)激反應(yīng)；隨后，隨著脅迫溫度的繼續(xù)降低，可溶性糖含量下降，可能是因為隨著溫度的進一步降低，超出了小葉樸的耐受范圍，使細胞受到嚴(yán)重的損害。

3 討論與結(jié)論

3.1 低溫脅迫對細胞膜酶活性的影響

SOD在植物抵抗低溫危害的過程中，可以通過增加其活性，清除氧自由基，減少膜脂過氧化，對細胞膜系統(tǒng)損傷起保護作用[10]。本試驗結(jié)果表明，隨著脅迫溫度的降低，小葉樸離體葉片SOD的活性呈先上升后下降的變化趨勢，這與曹慧等[11]就低溫脅迫對葡萄幼苗相關(guān)生理指標(biāo)的影響研究結(jié)果相一致。

3.2 低溫脅迫對膜透性的影響

細胞膜系統(tǒng)能夠穩(wěn)定細胞的內(nèi)部環(huán)境，在物質(zhì)運輸、能量轉(zhuǎn)換、信息傳遞中起決定性作用，是細胞賴以生存的基礎(chǔ)[12]。細胞膜具有選擇透過性，當(dāng)植物低溫脅迫后細胞膜受損，會導(dǎo)致電導(dǎo)率上升[13]。本試驗結(jié)果表明，隨著脅迫溫度的降低，小葉樸離體葉片電導(dǎo)率一直升高，這與馬艷青等[14]在茄子上的研究結(jié)果一致。植物在受到嚴(yán)重的低溫脅迫后，細胞膜會受到損害，細胞內(nèi)含物不斷外滲，導(dǎo)致浸出液的電導(dǎo)率持續(xù)增高。

3.3 低溫脅迫對植物滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

植物體內(nèi)的游離脯氨酸含量增加可增大植物滲透壓，是細胞質(zhì)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[15]，陳為京等[16]認(rèn)為增加脯氨酸含量有助于植物適應(yīng)低溫。本試驗結(jié)果表明，隨著脅迫溫度的降低，小葉樸離體葉片脯氨酸含量呈先升高后降低的變化趨勢，這與方媛等[17]就低溫脅迫對3個黃瓜品種幼苗生理特性的影響研究結(jié)果一致。前期脯氨酸含量上升是因為低溫脅迫下積累脯氨酸，增強滲透調(diào)節(jié)能力，是小葉樸離體葉片對低溫的一種適應(yīng)反應(yīng)，增強抗低溫傷害的能力，后來下降說明超出小葉樸離體葉片自身調(diào)節(jié)能力。

適時的低溫鍛煉能使可溶性糖在植物體內(nèi)積累，有效提高細胞滲透濃度，進而提高植物的抗寒能力[19]。本試驗結(jié)果表明，隨脅迫溫度的降低，小葉樸離體葉片可溶性糖含量呈先上升后下降的變化趨勢，與王小媚等[18]就低溫脅迫對楊桃品種抗寒生理生化指標(biāo)的影響研究結(jié)果相符。適時的低溫鍛煉能使可溶性糖在植物體內(nèi)積累，有效提高細胞滲透濃度，進而提高植物的抗寒能力[19]。故小葉樸離體葉片可溶性糖含量前期呈上升趨勢，后來超過自身耐受水平含量下降。

本試驗結(jié)果表明，可溶性蛋白含量呈下降趨勢，可能是由于在低溫脅迫條件下，小葉樸離體葉片可溶性蛋白迅速分解為各種氨基酸，使得滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量升高，葉片滲透勢降低，植株滲透調(diào)節(jié)能力增強，促進水分的吸收，從而減輕低溫脅迫對植株的傷害。綜上所述，隨著脅迫溫度的降低，小葉樸離體葉片細胞膜受到傷害導(dǎo)致膜透性增加，但在溫度高于-10 ℃時，尚可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)酶活性、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來提高自身的抗寒能力，但當(dāng)溫度低于-10 ℃時，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和保護酶活性亦降低，說明超出其耐受范圍。

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