西南地區(qū)古楊樹(shù)遺傳多樣性的SSR分析

縱 丹，周安佩，張 垚，李 旦，段麗華，何承忠,5*

(1 西南林業(yè)大學(xué) 云南省高校林木遺傳改良與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224; 2 西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224; 3 西南林業(yè)大學(xué) 云南生物多樣性研究院，昆明 650224; 4 昆明市林業(yè)科學(xué)研究所，昆明 650223; 5 西南林業(yè)大學(xué) 西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650224)

古樹(shù)在多個(gè)自然環(huán)境因子以及人為因子長(zhǎng)期綜合作用下生存下來(lái)，已經(jīng)適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂蚣巴寥赖拳h(huán)境條件，是最地道的鄉(xiāng)土樹(shù)種，具有較強(qiáng)的耐逆境能力，蘊(yùn)藏有長(zhǎng)壽及抗逆性等有價(jià)值的基因，因此，一棵古樹(shù)就是一個(gè)基因庫(kù)，是植物遺傳改良的寶貴種質(zhì)材料[1]，也具有重要的科研價(jià)值和社會(huì)價(jià)值[2-3]。

中國(guó)西南地區(qū)具有特殊的地形地貌及獨(dú)特的地史條件，既有高原平面，又有高山峽谷，干熱河谷氣候、山地氣候與高原氣候并存，特別是橫斷山區(qū)山川胼列，南北走向，在第四世紀(jì)冰期來(lái)臨時(shí)，為植物的退避提供了優(yōu)異的條件[4-5]，從而使該區(qū)域蘊(yùn)藏有豐富的楊樹(shù)(PopulusL.)資源，是中國(guó)楊樹(shù)自然分布及演化中心之一[4,6-8]。在資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，西南地區(qū)分布著豐富的楊樹(shù)古樹(shù)資源，且樹(shù)齡之古老，在現(xiàn)存的楊樹(shù)資源中極為罕見(jiàn)，如四川省理塘縣向陽(yáng)寺周邊及院內(nèi)的西南楊(P.schneideri)，據(jù)記載是達(dá)賴三世率領(lǐng)僧侶于1546年種植[4]，距今已有近500年的樹(shù)齡。西藏昌都縣現(xiàn)存的一片昌都楊(P.qamdoensis)古樹(shù)，胸徑均在2 m以上，據(jù)當(dāng)?shù)鼐用窆浪?，?shù)齡在400年左右。這些珍稀而罕見(jiàn)的楊樹(shù)古樹(shù)既是研究楊屬系統(tǒng)發(fā)育的理想材料，也是進(jìn)行楊樹(shù)遺傳改良、種質(zhì)創(chuàng)新的難得珍稀資源，可供選擇育種的基因資源開(kāi)發(fā)利用潛力很大[9]。通過(guò)對(duì)楊樹(shù)古樹(shù)遺傳多樣性的研究，能夠充分了解其遺傳變異水平、遺傳結(jié)構(gòu)及其遺傳變異規(guī)律，從而為資源收集與保護(hù)、選擇育種、雜交親本選配等提供科學(xué)依據(jù)[10-12]。然而，目前關(guān)于該區(qū)域楊樹(shù)古樹(shù)的研究?jī)H限于資源調(diào)查報(bào)道[4,9,13]，其遺傳多樣性研究等尚為空白。為此，本研究采集西南地區(qū)分布的川楊(P.szechuanica)、康定楊(P.kangdingensis)、鄉(xiāng)城楊(P.xiangchengensis)、西南楊、藏川楊(P.szechuanicavar.tibetica)、德欽楊(P.haoana)和昌都楊7個(gè)種15個(gè)群體共226個(gè)楊樹(shù)古樹(shù)個(gè)體，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，從DNA水平對(duì)楊樹(shù)古樹(shù)的遺傳多樣性及其遺傳關(guān)系進(jìn)行分析，以期為該區(qū)域楊樹(shù)古樹(shù)資源的合理保護(hù)、收集與保存、科學(xué)開(kāi)發(fā)與利用等提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以行政區(qū)劃的縣域作為群體劃分依據(jù)，在同一縣域內(nèi)采集的同種楊樹(shù)古樹(shù)個(gè)體歸為一個(gè)群體。分別在云南、四川和西藏3省11個(gè)縣域內(nèi)選取川楊、康定楊、鄉(xiāng)城楊、西南楊、藏川楊、德欽楊和昌都楊共7種15個(gè)群體226株胸徑在1 m以上的楊樹(shù)古樹(shù)樣株(表1和圖1)，采集新鮮嫩葉用變色硅膠干燥保存，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1.2 方 法

1.2.1基因組DNA提取采用改良SDS法依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)酚/氯仿流程提取樣本基因組總DNA[14]，利用1%瓊脂糖凝膠電泳和核酸蛋白檢測(cè)儀對(duì)所提取的基因組總DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，-20 ℃保存，備用。

1.2.2SSR分析PCR反應(yīng)體系(10 L)：10×PCR 緩沖液(含25 mmol/L Mg2+)1 L，dNTPs(2.5 mmol/L)0.7 L，上下游引物(10 mol/L)各1.5 L，Taq DNA聚合酶(2.5 U/L)0.25 L，DNA模板2.5 L，雙蒸水補(bǔ)足至10 L。

PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃～60 ℃(不同引物退火溫度不同，詳見(jiàn)表2)退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳產(chǎn)物采用銀染法進(jìn)行顯影。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析根據(jù)每個(gè)測(cè)試樣本的擴(kuò)

增產(chǎn)物在凝膠中電泳分離的帶型差異，記為AA/AB/AC/BC等，構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣。采用POPGENE version 1.32[15]軟件計(jì)算觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Shannon’s信息指數(shù)(I)、Nei’s遺傳相似系數(shù)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、Nei’s期望雜合度(Hn)、平均雜合度(Ha)以及固定指數(shù)Fis、Fit和遺傳分化系數(shù)Fst及基因流Nm；基于Nei’s遺傳相似系數(shù)，采用NTSYS軟件[16]分別對(duì)楊樹(shù)古樹(shù)種間及群體間進(jìn)行聚類分析；采用Structure 2.3.1進(jìn)行Bayesian分析[17]，其模型選擇混合模型和相關(guān)等位基因模型，預(yù)迭代次數(shù)設(shè)置為104，基于馬爾科夫鏈的蒙特卡羅迭代運(yùn)算105次，需檢測(cè)的聚類數(shù)值K設(shè)定為1～20，每次檢測(cè)均獨(dú)立運(yùn)行20次，采用Clumpp 1.1.2[18]進(jìn)行數(shù)據(jù)的整理和分析。參照Evanno等[19]的方法確定最佳K值，聚類圖通過(guò)Distruct 1.1[20]進(jìn)行繪制。

圖1 試驗(yàn)樣本采集地分布圖Fig.1 Collection map of the experimental samples

表1 試驗(yàn)材料來(lái)源基本信息Table 1 Basic information of experimental material source

表2 SSR引物序列及退火溫度Table 2 The primer sequences and annealing temperature of SSR

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹(shù)古樹(shù)遺傳多樣性分析

篩選出7對(duì)SSR引物用于7種15個(gè)群體226株楊樹(shù)古樹(shù)樣本分析，共擴(kuò)增得到80個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每對(duì)SSR引物擴(kuò)增出多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)在5～20個(gè)之間，平均為11.4個(gè)。POPGENE軟件分析結(jié)果表明(表3)，楊樹(shù)種間古樹(shù)的遺傳多樣性參數(shù)存在較大差異，其中西南楊Ne最高，達(dá)3.920 8，德欽楊最低，僅為2.185 5；I最高值出現(xiàn)在藏川楊(1.401 4)，其余依次為西南楊(1.382 4)、昌都楊(1.374 7)、康定楊(1.371 6)、鄉(xiāng)城楊(1.284 0)、川楊(0.997 8)和德欽楊(0.901 7)；Hn的變化范圍為0.520 1～0.716 9，最高者是藏川楊(0.716 9)，最低者為德欽楊(0.520 1)。川楊Ho略高于He，而康定楊Ho與He較為接近，其余5個(gè)種Ho均低于He。以檢測(cè)到的Ne作為標(biāo)準(zhǔn)，7種楊樹(shù)古樹(shù)遺傳多樣性水平由高到低依次為西南楊>昌都楊>康定楊>藏川楊>鄉(xiāng)城楊>川楊>德欽楊。

楊樹(shù)古樹(shù)種內(nèi)群體間遺傳多樣性分析結(jié)果表明，鄉(xiāng)城楊3個(gè)群體之間的多態(tài)性位點(diǎn)百分率變化范圍在71.43%～100%之間，Ne在2.207 9～3.303 2之間，I在0.710 1～1.194 7之間，Hn介于0.428 6～0.585 4之間，且均表現(xiàn)為GDX > GIX > GYX，其中GYX群體Ho遠(yuǎn)高于He，其余2個(gè)群體Ho略低于He；西南楊3個(gè)群體中，GDN群體多態(tài)性位點(diǎn)百分率為71.43%，而GLN群體和GIN群體均為100%，Ne和I在西南楊3個(gè)群體中的變化規(guī)律表現(xiàn)為GLN > GIN > GDN，且3個(gè)群體Ho高于He；藏川楊2個(gè)群體的多態(tài)性位點(diǎn)百分率均為100%，Ne和I較為接近，Ho低于He；Ne和I在德欽楊2個(gè)群體中的變化規(guī)律表現(xiàn)為GZD > GED，Ho低于He；昌都楊3個(gè)群體Ne和I均表現(xiàn)為HM > HG > HC，其中HM和HC群體Ho低于He，HG群體Ho高于He。

2.2 楊樹(shù)古樹(shù)的群體遺傳分析(F-統(tǒng)計(jì)量)

以群體數(shù)不少于2的樹(shù)種作為分析單元，分別對(duì)鄉(xiāng)城楊、西南楊、藏川楊、德欽楊和昌都楊的F-統(tǒng)計(jì)量進(jìn)行分析，結(jié)果(表4)表明，鄉(xiāng)城楊Fis平均值為-0.024 6，表明鄉(xiāng)城楊群體內(nèi)雜合體較多；Fst變化范圍在0.017 3～0.445 3之間，平均值為0.156 1，說(shuō)明總的遺傳變異中只有15.61%存在于群體間；群體間基因流平均值為1.351 3，表明鄉(xiāng)城楊3個(gè)群體間存在一定的基因交流。西南楊7個(gè)位點(diǎn)中，除ORPM203和WPMS5位點(diǎn)Fis為正值，其余位點(diǎn)均為負(fù)值，平均值為-0.253 5，表明西南楊群體內(nèi)雜合子過(guò)量；Fst平均值為0.253 5，而Nm為0.736 3，表明西南楊群體間遺傳分化相對(duì)較大，而基因流較小。藏川楊、德欽楊和昌都楊Fis分別為0.205 4、0.240 1和0.029 2，表明藏川楊、德欽楊和昌都楊群體內(nèi)均存在一定程度的近交，在總的遺傳變異中分別有12.88%、18.20%和17.73%的遺傳變異存在于群體間，群體間基因流分別為1.691 0、1.123 5和1.160 3，即藏川楊、德欽楊和昌都楊的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)不同個(gè)體之間，且群體間存在一定的基因交流(表4)。此外，5種楊樹(shù)古樹(shù)群體的Fit值均大于Fis值，說(shuō)明群體間的雜合水平高于群體內(nèi)，因此，從各樹(shù)種不同群體中進(jìn)行個(gè)體選擇可以獲得較明顯的增益。

表3 西南地區(qū)7種楊樹(shù)古樹(shù)的遺傳多樣性分析參數(shù)Table 3 Genetic diversity parameters of 7 large old poplars in southwest China

2.3 聚類分析

7種楊樹(shù)的遺傳相似系數(shù)介于0.089 0～0.691 0之間，平均為0.402 0。其中，川楊與康定楊之間的遺傳相似系數(shù)最大，相似性水平最高，川楊與藏川楊之間的遺傳相似性水平最低，二者之間的分化程度最大?；诟鞣N間的Nei’s遺傳相似系數(shù)，采用NTSYS軟件對(duì)7種楊樹(shù)進(jìn)行UPGMA聚類分析，由聚類結(jié)果(圖2)可看出，以0.450 0為閾值，7種楊樹(shù)被明顯地聚分為3大組，其中川楊和康定楊構(gòu)成第1組，鄉(xiāng)城楊和西南楊構(gòu)成了第2組，第3組由藏川楊、德欽楊和昌都楊構(gòu)成。

7種楊樹(shù)15個(gè)古樹(shù)群體的遺傳相似系數(shù)變化范圍在0.000 0～0.792 0之間，平均值為0.395 0。

圖2 西南地區(qū)7種楊樹(shù)古樹(shù)的種間聚類結(jié)果Fig.2 Dendrogram among 7 large old poplars in southwest China

其中昌都楊昌都群體(HC)和貢覺(jué)群體(HG)之間的遺傳相似系數(shù)最大，二者之間的相似水平最高，而西南楊稻城群體(GDN)和德欽楊德欽群體(GED)遺傳相似水平最低。基于其遺傳相似系數(shù)，采用NTSYS軟件進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果(圖3)顯示，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.330 0時(shí)，15個(gè)群體可被分為3個(gè)大組：第1大組包括川楊的瀘定群體(GUC)、康定楊的康定群體(GXK)、鄉(xiāng)城楊的3個(gè)群體(GDX、GIX和GYX)和西南楊的理塘群體(GLN)；第2大組由西南楊的2個(gè)群體(GDN和GIN)組成；其余7個(gè)群體構(gòu)成第3大組。進(jìn)一步對(duì)第1大組和第3大組進(jìn)行聚分，當(dāng)遺傳相似系數(shù)為0.480 0時(shí)，可將第1大組分為2個(gè)亞組，其中：川楊與康定楊為第1亞組，鄉(xiāng)城楊的3個(gè)群體及西南楊的理塘群體為第2亞組；第3大組分為2個(gè)亞組，其中：藏川楊的2個(gè)群體為第1個(gè)亞組，德欽楊的2個(gè)群體和藏川楊的3個(gè)群體為第2亞組。由此可見(jiàn)，除西南楊的理塘群體(GLN)與分城楊的3個(gè)群體聚為1組外，其余群體均可依據(jù)樹(shù)種進(jìn)行聚類，表明西南楊理塘群體(GLN)與鄉(xiāng)城楊之間具有一定的遺傳關(guān)系。

表4 西南地區(qū)5種楊樹(shù)古樹(shù)的群體遺傳分析(F-統(tǒng)計(jì)量)結(jié)果Table 4 The result of population genetic analysis of 5 large old poplars in southwest China (F-statistic)

注：Fis.群體內(nèi)近交系數(shù)；Fit.群體總近交系數(shù)；Fst.群體間遺傳分化系數(shù)；Nm.群體間基因流
Notes:Fis. The inbreeding coefficient among populations;Fit. The total inbreeding coefficient among populations;Fst. The coefficient of genetic differentiation among populations;Nm. The gene flow among populations

圖3 西南地區(qū)7種楊樹(shù)古樹(shù)不同群體的聚類結(jié)果Fig.3 Dendrogram of different populations of 7 large old poplars in southwest China

圖4 K值判定Fig.4 The identification of K value

Bayesian分析的關(guān)鍵在于最佳K值的選擇。本研究利用Structure軟件[19]對(duì)226株楊樹(shù)古樹(shù)的群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并采用2種方法確定最優(yōu)K值，圖4，A為基于Evanno等提出的方法[17,19]，當(dāng)K值為3時(shí)，LK的上升趨勢(shì)減緩，并逐漸趨于穩(wěn)定，結(jié)合圖4，B，K值在K=3時(shí)最大(6.48)，K=4時(shí)次之(5.86)，二者僅相差0.62，因此，分別對(duì)K=3和K=4進(jìn)行聚類分析。當(dāng)K=3時(shí)可將15個(gè)群體226株楊樹(shù)古樹(shù)分為3個(gè)組(圖5，A)，第1組(藍(lán)色)由川楊和康定楊組成，第2組(紅色)由德欽楊2個(gè)群體(香格里拉和德欽群體)和昌都楊3個(gè)群體(芒康、昌都和貢覺(jué)群體)組成，其余楊樹(shù)古樹(shù)在第3組(綠色)中混雜分布，其中鄉(xiāng)城楊與西南楊具有較近的親緣關(guān)系，而藏川楊與德欽楊和昌都楊親緣關(guān)系較近。當(dāng)K=4時(shí)，聚類結(jié)果與K=3時(shí)類似，只是將藏川楊2個(gè)群體與鄉(xiāng)城楊和西南楊區(qū)分開(kāi)來(lái)(圖5，B)；Bayesian分析結(jié)果與UPGMA聚類分析結(jié)果一致。

3 討 論

基因多樣性或基因雜合度是群體內(nèi)每個(gè)位點(diǎn)上雜合體所占的比率或一個(gè)個(gè)體所有雜合位點(diǎn)的比率，也稱為遺傳多樣性，是物種進(jìn)化、選擇、發(fā)生、創(chuàng)新和重組的物質(zhì)基礎(chǔ)[21-22]。遺傳多樣性評(píng)估主要采用的指標(biāo)有多態(tài)帶百分率、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)及觀測(cè)雜合度和期望雜合度等[23-26]，其中，基因雜合度和有效等位基因數(shù)是度量遺傳變異的重要參數(shù)，期望雜合度的大小可以反映遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低[27-28]，雜合度高則遺傳變異大，反之則變異小，而遺傳變異的大小是衡量選擇潛力的依據(jù)，變異大選擇潛力大，反之則選擇潛力小[29]。曾淇等[28]采用SSR分子標(biāo)記對(duì)46份荔枝種質(zhì)資源遺傳多樣性進(jìn)行分析，22個(gè)SSR位點(diǎn)的平均期望雜合度為0.355 0，表明荔枝群體的遺傳結(jié)構(gòu)變異程度為中等。馮源恒等[30]采用SSR標(biāo)記對(duì)拉雅松(Pinuscrassicorticea)遺傳多樣性進(jìn)行研究，7對(duì)SSR引物組合共檢測(cè)有效等位基因數(shù)為1.653 0，Shannon’s信息指數(shù)為0.540 0，觀測(cè)雜合度為0.577 0，期望雜合度為0.374 0，表明拉雅松具有較高水平的遺傳多樣性。包文泉等[31]基于SSR標(biāo)記對(duì)新源縣、霍城縣、伊寧縣和鞏留縣4個(gè)群體共80份新疆野杏樣本的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，在群體水平上，27對(duì)SSR引物共檢測(cè)有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)、觀測(cè)雜合度和期望雜合度分別為5.85、1.92和0.79和0.55，且新源縣野杏群體遺傳多樣性最豐富，鞏留縣群體遺傳多樣性最低。本研究采用SSR標(biāo)記對(duì)7種楊樹(shù)古樹(shù)遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明7種楊樹(shù)古樹(shù)的有效等位基因數(shù)變化范圍在2.188 5～3.920 8之間，Shannon’s信息指數(shù)在0.901 7～1.401 4之間，觀測(cè)雜合度和期望雜合度變化范圍分別介于0.363 1～0.741 5和0.531 2～0.726 5之間，德欽楊各項(xiàng)遺傳參數(shù)均表現(xiàn)最低，表明7種楊樹(shù)古樹(shù)均具有較高的遺傳多樣性，而德欽楊的遺傳多樣性較其余種低。GYX群體的多態(tài)性位點(diǎn)百分率、有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s期望雜合度均低于GIXGDX群體，且GYX群體觀測(cè)雜合度遠(yuǎn)高于期望雜合度，GYX群體個(gè)體數(shù)量較少，導(dǎo)致群體不同程度的近交，從而使其純合機(jī)率增加，雜合度降低，其余2個(gè)群體觀測(cè)雜合度略低于期望雜合度，群體內(nèi)不同個(gè)體間的遺傳多樣性豐富。昌都楊3個(gè)群體(HM、HC、HG)和西南楊3個(gè)群體(GLN、GDN、GIN)的有效等位基因數(shù)、Shannon’s信息指數(shù)和Nei’s期望雜合度3項(xiàng)遺傳參數(shù)的大小順序依次為HM>HG>HC，GLN>GIN>GDN，GLN群體觀測(cè)雜合度與期望雜合度較為接近，西南楊其余2個(gè)群體和昌都楊3個(gè)群體，觀測(cè)雜合度與期望雜合度之間均有一定差值，表明不同群體在生長(zhǎng)過(guò)程中受到外來(lái)選擇、近交以及一些非隨機(jī)因素的影響，而偏離了遺傳平衡狀態(tài)[32]。

圖5 西南地區(qū)7種楊樹(shù)古樹(shù)及其群體的Bayesian分析結(jié)果Fig.5 The Bayesian analysis of 5 large old poplars and their populations in southwest China

Wright提出的3個(gè)固定指數(shù)Fis、Fit和Fst是反映群體近交程度和遺傳分化程度的指標(biāo)，F(xiàn)is和Fit值介于-1～1之間，其值越大說(shuō)明近交越嚴(yán)重；Fst值變化范圍為0～1之間，值越大說(shuō)明群體間遺傳分化越明顯[33]。薄文浩[34]應(yīng)用SSR分子標(biāo)記對(duì)藏川楊不同群體的近交程度進(jìn)行分析，結(jié)果表明除林芝群體近交系數(shù)接近0.2，拉薩、日喀則和山南來(lái)源藏川楊近交系數(shù)均接近0，說(shuō)明林芝群體存在藏川楊純合子相對(duì)雜合子過(guò)量的現(xiàn)象，其余3個(gè)群體雜合子與純合子比例接近，藏川楊可以完全隨機(jī)交配。本研究中，鄉(xiāng)城楊群體內(nèi)近交系數(shù)Fis為-0.024 6，表明鄉(xiāng)城楊群體內(nèi)雜合子較多，群體間遺傳分化系數(shù)為0.156 1，即在總的遺傳變異中只有15.61%的變異存在于群體間，群體間基因流為1.351 3，表明鄉(xiāng)城楊3個(gè)不同群體間存在一定的基因交流。鄉(xiāng)城楊群體間較小的遺傳變異和較高基因交流可能主要來(lái)源于人為引種栽培。西南楊群體內(nèi)近交系數(shù)為-0.253 5，表明西南楊群體內(nèi)雜合子過(guò)量，群體間遺傳分化系數(shù)為0.253 5，基因流為0.736 3，即西南楊群體間基因交流受阻，從而使其走向遺傳分化，而西南楊不同群體之間的地理隔離可能是導(dǎo)致群體基因交流受阻的主要原因。藏川楊、德欽楊和昌都楊群體間近交系數(shù)分別為0.205 4、0.240 1和0.029 1，群體間遺傳變異分別占總變異的12.88%、18.20%和17.73%，表明藏川楊、德欽楊和昌都楊群體內(nèi)均存在一定程度的近交，純合子相對(duì)雜合子過(guò)量，且不同群體間存在一定程度的基因交流。由此可見(jiàn)，西南地區(qū)楊樹(shù)古樹(shù)的遺傳變異豐富，無(wú)論從各樹(shù)種的群體內(nèi)進(jìn)行選擇，或是從群體間進(jìn)行選擇，均可獲得較大的遺傳增益。

在遺傳水平上，遺傳相似系數(shù)的變幅越大，種內(nèi)遺傳差異越大，遺傳多樣性越高，反之遺傳相似系數(shù)越接近，物種親緣關(guān)系越近[35]。鄉(xiāng)城楊稻城、鄉(xiāng)城和雅江3個(gè)群體之間的遺傳相似系數(shù)介于0.600 0～0.766 0之間，變幅較小，在聚類圖中，鄉(xiāng)城楊3個(gè)群體也聚合在一起，表明雖然不同群體間由于較遠(yuǎn)的地理隔離發(fā)生了一定的分化，但在DNA水平上還可以保持一定的同源性和一致性。由昌都楊群體間的遺傳相似系數(shù)可知，昌都群體與貢覺(jué)群體遺傳相似系數(shù)較大(0.792 0)，芒康群體與昌都群體和貢覺(jué)群體的遺傳相似系數(shù)分別為0.633 0和0.404 0，且在UPGMA聚類圖中也表現(xiàn)為昌都群體與貢覺(jué)群體聚在一起，這是由于東達(dá)山等山脈形成了地理隔離，導(dǎo)致昌都楊芒康群體與其余2個(gè)群體之間的遺傳相似系數(shù)較小，親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。西南楊群體的聚類結(jié)果顯示，西南楊理塘群體與鄉(xiāng)城楊3個(gè)群體聚為一類，而其余2個(gè)群體聚為一類，這一結(jié)果進(jìn)一步支持了劉友全等[36]依據(jù)表型特征認(rèn)為鄉(xiāng)城楊是西南楊與長(zhǎng)序楊(P.pseudoglauca)的自然雜交種的觀點(diǎn)。何承忠等[37]對(duì)西南藏區(qū)山楊(P.davidiana)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，西南地區(qū)錯(cuò)綜分布的山脈對(duì)山楊群體具有顯著的隔離作用。本研究中西南楊不同群體間有海子山、兔兒山及無(wú)名山等高大山脈的阻隔，可能是導(dǎo)致西南楊群體間存在較大遺傳差異的原因。

川楊與藏川楊的表型特征非常相似，區(qū)別僅為藏川楊葉初時(shí)兩面有短柔毛，后僅沿葉脈有柔毛，芽和葉柄均有短柔毛，而川楊的葉、葉柄及芽均無(wú)毛[38]。本研究中，藏川楊與川楊間的遺傳相似系數(shù)較低，在種水平或群體水平均未能相聚，與Wan等[39]采用AFLP標(biāo)記與trnT-trnF片段序列、員濤等[40]采用SRAP標(biāo)記、李佳蔓等[41]采用cpDNA和rDNAITS片段序列的研究結(jié)果一致。中國(guó)西南地區(qū)獨(dú)特的地形地貌，復(fù)雜多樣的氣候條件，縱橫交錯(cuò)的山脈阻隔以及強(qiáng)烈的冰川作用，造就了變化多端的楊樹(shù)生境條件，使該區(qū)域分布楊樹(shù)的表型可塑性較為豐富，且青楊派樹(shù)種之間的自然雜交現(xiàn)象極為普遍，致使該區(qū)域楊樹(shù)系統(tǒng)關(guān)系及分類地位的確定難度較大[4,36]。本研究基于群體的聚類分析也證實(shí)了西南地區(qū)楊樹(shù)之間較為復(fù)雜的遺傳關(guān)系。

通過(guò)對(duì)西南地區(qū)楊樹(shù)古樹(shù)的遺傳多樣性研究表明，楊樹(shù)古樹(shù)具有較高的遺傳多樣性，且遺傳變異主要存在于群體內(nèi)不同個(gè)體之間，因此任何個(gè)體的喪失均會(huì)導(dǎo)致楊樹(shù)古樹(shù)遺傳多樣性的降低或喪失。然而前期對(duì)西南地區(qū)楊樹(shù)古樹(shù)資源調(diào)查的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，許多楊樹(shù)古樹(shù)的樹(shù)干出現(xiàn)腐朽、中空等損傷，且尚未采取任何的保護(hù)措施，最終將會(huì)導(dǎo)致楊樹(shù)古樹(shù)的死亡與消失，因此，亟需對(duì)西南地區(qū)不同種的楊樹(shù)古樹(shù)資源進(jìn)行就地保護(hù)、擴(kuò)繁保護(hù)及收集保存。此外，經(jīng)歷上百年甚至幾百年生長(zhǎng)歷程保存下來(lái)的古樹(shù)，蘊(yùn)藏有長(zhǎng)壽、抗病蟲(chóng)害、抗鹽堿性、抗旱和抗寒以及其他具有巨大應(yīng)用潛力的珍稀基因資源，而這些楊樹(shù)古樹(shù)中優(yōu)良基因資源的開(kāi)發(fā)與利用，還有待于進(jìn)一步深入發(fā)掘，從而服務(wù)于中國(guó)楊樹(shù)育種事業(yè)。

參考文獻(xiàn):

[1] 胡堅(jiān)強(qiáng), 夏有根, 梅 艷, 等. 古樹(shù)名木研究概述[J]. 福建林業(yè)科技, 2004,31(3): 151-154.

HU J Q, XIA Y G, MEI Y,etal. Research of the ancient and famous trees in China[J].JournalofFujianForestryScienceandTechnology, 2004,31(3): 151-154.

[2] LINDENMAYER D B, LAURANCE W F, FRANKIN J F. Global decline in large old trees[J].Science, 2012,338(6112): 1 305-1 306.

[3] FAISON E K. Large old tree declines at broad scales: a more complicated story[J].ConservationLetters, 2014,7(1): 70-71.

[4] 余樹(shù)全, 劉 軍, 付達(dá)榮, 等. 川西高原青楊派基因資源特點(diǎn)[J]. 浙江林學(xué)院學(xué)報(bào), 2003,20(1): 27-31.

YU S Q, LIU J, FU D R,etal. Characteristics ofTacamahacagenes in the Western Sichuan plateau[J].JournalofZhejiangForestryCollege, 2003,20(1): 27-31.

[5] 龔固堂. 楊屬地理分布與起源初探[J]. 四川林業(yè)科技, 2004,25(2): 25-30.

GONG G T. The geographic distribution and origin ofPopulusL.[J].JournalofSichuanForestryScienceandTechnology, 2004,25(2): 25-30.

[6] 趙 能, 劉 軍. 中國(guó)西南地區(qū)楊屬的分類學(xué)研究(I)[J]. 武漢植物學(xué)研究, 1991,9(3): 229-238.

ZHAO N, LIU J. Taxonomic studies onPopulusL. in southwest China (I)[J]. JournalofWuhanBotanicalResearch, 1991,9(3): 229-238.

[7] 劉 軍. 川西高原青楊派楊樹(shù)的地理類型[J]. 四川林業(yè)科技, 1997,18(2): 36-39.

LIU J. Geographical types ofTacamahacain the western Sichuan plateau[J].JournalofSichuanScienceandTechnology, 1997,18(2): 36-39.

[8] WAN X Q, ZHANG F. An overview ofPopulusgenetic resources in southwest China[J].TheForestryChronicle, 2013,89(1): 79-87.

[9] 萬(wàn)雪琴, 張 帆, 鐘 宇, 等. 中國(guó)西南地區(qū)鄉(xiāng)土楊樹(shù)基因資源的保護(hù)與利用[J]. 林業(yè)科學(xué), 2009,45(4): 139-144.

WAN X Q, ZHANG F, ZHONG Y,etal. Conservation and application of the genetic resource of native poplars in southwest China[J].ScientiaSilvaeSinicae, 2009,45(4): 139-144.

[10] LEE K M, KIM Y Y, HYUN J. Genetic variation in populations ofPopulusdavidianaDode based on microsatellite marker analysis[J].GenesandGenomics, 2011,33(2): 163-171.

[11] ADAMI M, FRANCESCHI P D, BRANDI F,etal. Identifying a carotenoid cleavage dioxygenase (ccd4) gene controlling yellow/white fruit flesh color of peach[J].PlantMolecularBiologyReporter, 2013,31(5): 1 166-1 175.

[12] VENDRAMIN E, PEA G, DONDINI L,etal. A unique mutation in a MYB gene cosegregates with the nectarine phenotype in peach[J].PLoSOne, 2014,9(10): e90574.

[13] 賈 晨, 鄢武先, 何承忠, 等. 川西高原鄉(xiāng)土楊樹(shù)古樹(shù)資源調(diào)查及保護(hù)對(duì)策[J]. 四川林業(yè)科技, 2014,35(1): 31-35.

JIA C, YAN W X, HE C Z,etal. Investigation and protection of large old native poplars in West Sichuan plateau[J].JournalofSichuanForestryScienceandTechnology, 2014,35(1): 31-35.

[14] MURRAY M, THOMPSON W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].NucleicAcidsResearch, 1980,8(19): 4 321-4 326.

[15] YEH F C, YANG R, BOYLE T J. PopGene32, Microsoft Windows-based Freeware for Population Genetic Analysis (version 1.32)[M]. Alberta, Canada: Molecular Biology and Biotechnology Centre, University of Alberta, 1999.

[16] ROHLF F J. NTSYS-pc Numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.02 User Guide [M]. Applied Biostatistics lnc, Exeter Software, Setauket, New York, 1997.

[17] PRITCHARD J K, STIPHENS M, DONNELLY P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J].Genetics, 2000,155(2): 945-959.

[18] JAKOBSSON M, ROSENBERG N A. CLUMPP: a cluster matching and permutation program for dealing with label switching and multimodality in analysis of population structure[J].Bioinformatics, 2007,23(14): 1 801-1 806.

[19] EVANNO G, REGNAUT S, GOUDET J. Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE: a simulation study[J].MolecularEcology, 2005,14(8): 2 611-2 620.

[20] ROSENBERG N A. DISTRUCT: a program for the graphical display of population structure[J].MolecularEcologyResources, 2004,4(1): 137-138.

[21] 張 靜. 利用SSR分子標(biāo)記研究山楊雜種無(wú)性系的遺傳多樣性[D]. 哈爾濱: 東北林業(yè)大學(xué), 2003.

[22] 徐愛(ài)遐, 馬朝芝, 肖恩時(shí), 等. 中國(guó)西部芥菜型油菜遺傳多樣性研究[J]. 作物學(xué)報(bào), 2008,34(5): 754-763.

XU A X, MA C Z, XIAO E S,etal. Genetic diversity ofBrassicajunceafrom Western China[J].ActaAgronomicaSinica, 2008,34(5): 754-763.

[23] NEI M. Analysis of gene diversity in subdivided populations[J].ProceedingsoftheNationalAcademyScienceofUSA, 1973,70(12): 3 321-3 323.

[24] NEI M. F-statistics and analysis of gene diversity in subdivided populations[J].AnnalsofHumanGenetics, 1977,41(2): 225-233.

[25] RIEGER R, MICHELIS A, GEEN M M. Glossary of genetics[M]. Berlin: Springer-Verlag, 1991: 209.

[26] 王伯蓀, 彭少麟. 植被生態(tài)學(xué)-群落與生態(tài)系統(tǒng)[M]. 北京: 中國(guó)環(huán)境科學(xué)技術(shù)出版社, 1997: 201-220.

[27] 蓋鈞鎰. 植物種質(zhì)群體遺傳結(jié)構(gòu)改變的速度[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2005,6(1): 1-8.

GAI J Y. Indicators related to genetic structure changes of plant germplasm population[J].JournalofPlantGeneticResources, 2005,6(1): 1-8.

[28] 曾 淇, 李明芳, 鄭學(xué)勤. 基于SSR標(biāo)記的荔枝種質(zhì)遺傳多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2010,11(3): 298-304．

ZENG Q, LI M F, ZHENG X Q. Analysis of genetic diversity withinLitchivarieties based on SSR markers[J].JournalofPlantGeneticResources, 2010,11(3): 298-304.

[29] 周炎花, 喬小燕, 馬春雷, 等. 廣西茶樹(shù)地方品種遺傳多樣和遺傳結(jié)構(gòu)的EST-SSR分析[J]. 林業(yè)科學(xué), 2011,47(3): 59-67.

ZHOU Y H, QIAO X Y, MA C L,etal. Genetic diversity and structure of tea landraces from Guangxi based on EST-SSR analysis[J].ScientiaSilvaeSinicae, 2011,47(3): 59-67.

[30] 馮源恒, 吳東山, 王德俊, 等. 拉雅松遺傳多樣性及同域分布種間親緣關(guān)系分析[J]. 廣西植物, 2014,34(3): 320-325.

FENG Y H, WU D S, WANG D J,etal. Genetic diversity ofPinuscrassicorticeaand its genetic relationship with two sympayric pine species[J].Guihaia, 2014,34(3): 320-325.

[31] 包文泉, 烏云塔娜, 王 淋, 等. 基于SSR標(biāo)記的新疆野杏群體遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2016,36(9): 1 757-1 763.

BAO W Q, WUYUN T N, WANG L,etal. Genetic diversity and population structure of wild Apricot in xinjiang revealed by SSR markers[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2016,36(9): 1 757-1 763.

[32] FERRIOL M, MERLE H, GARMENDIA A. Microsatellite evidence for low genetic diversity and reproductive isolation in tetraploidCentaureaseridis(Asteraceae) coexisting with diploidCentaureaasperaand triploid bybrids in contact zones[J].BotanicalJournaloftheLinnaeanSociety, 2015,176(1): 82-98.

[33] WRIGHT S. The genetical structure of populations[J].AnnalsofEugenics, 1951,15: 323-354.

[34] 薄文浩. 藏川楊遺傳多樣性及雜交子代遺傳變異研究[D]. 北京: 北京林業(yè)大學(xué), 2012

[35] 牛素貞, 劉玉倩, 楊錦標(biāo), 等. 貴州茶樹(shù)地方品種的EST-SSR遺傳多樣性分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2012,24(5): 836-841.

NIU S Z, LIU Y Q, YANG J B,etal. Analysis of genetic diversity of tea landrace resources in Guizhou by EST-SSR markers[J].ActaAgricultureZhejiangensis, 2012 ,24(5): 836-841.

[36] 劉友全, 付達(dá)榮. 川西高原青楊組基因資源及開(kāi)發(fā)利用[J]. 中南林學(xué)院學(xué)報(bào), 2004,24(5): 129-131.

LIU Y Q, FU D R. Development and utilization of Sec.Tacamachacagene resources on the plateau of western Sichuan[J].JournalofCentralsouthForestryUniversity, 2004,24(5) : 129-131.

[37] 何承忠, 李佳蔓, 員 濤, 等. 地理隔離對(duì)西南藏區(qū)山楊居群遺傳結(jié)構(gòu)影響的SRAP分析[J]. 林業(yè)科學(xué)研究, 2015,28(2): 152-157.

HE C Z, LI J M, YUN T,etal. SRAP analysis on the effect of geographic isolation on population genetic structure ofPopulusdavidianain Tibetan-inhabited regions in southwest China[J].ForestResearch, 2015,28(2): 152-157.

[38] 趙 能. 川西及其鄰近地區(qū)楊柳科植物分類的研究(三)[J]. 四川林業(yè)科技, 1994,15(2): 1-11.

ZHAO N. Taxonomic study on Salicaceae in Sichuan and its adjacent regions (Third)[J]. SichuanForestryScienceandTechnology, 1994,15(2): 1-11.

[39] WAN X Q, ZHANG F, ZHONG Y,etal. Study of genetic relationships and phylogeny of the nativePopulusin southwest China based on nucleotide sequence of chloroplasttrnT-trnF and nuclear DNA[J].PlantSystematicsandEvolution, 2012,299(1): 57-65.

[40] 員 濤, 顏璐茜, 李佳蔓, 等. 西南地區(qū)鄉(xiāng)土楊樹(shù)遺傳變異的SRAP分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào), 2015,16(4): 836-841.

YUN T, YAN L X, LI J M,etal. SRAP analysis of genetic variation among native poplars in southwest China[J].JournalofPlantGeneticResources, 2015,16(4): 836-841.

[41] 李佳蔓, 員 濤, 周安佩, 等. 基于cpDNA和rDNAITS片段分析西南地區(qū)青楊派楊樹(shù)的系統(tǒng)發(fā)育與進(jìn)化關(guān)系[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2015,35(6): 1 113-1 122.

LI J M, YUN T, ZHOU A P,etal. Phylogeny of poplar in sectionTacamahacaspecies from southwest China based on sequence data of cpDNA fragments and rDNAITS[J].ActaBotanicaBoreali-OccidentaliaSinica, 2015,35(6): 1 113-1 122.