杜仲葉片干旱脅迫響應相關差異蛋白的篩選與鑒定

趙 欣 白 偉

(1.陜西國際商貿(mào)學院醫(yī)藥學院，西安 712046； 2.西安聯(lián)創(chuàng)生物醫(yī)藥孵化器有限公司，西安 710065)

在干旱與半干旱地區(qū)，水資源短缺是影響植物生理生態(tài)和生長發(fā)育的最主要的逆境脅迫因子，大約50%的農(nóng)業(yè)減產(chǎn)均由干旱所致[1]。1/3的地表面積屬于干旱地區(qū)，這一數(shù)值正在加大，據(jù)美國紐約市立大學國家環(huán)境預報中心的研究發(fā)現(xiàn)，隨著環(huán)境尾氣排放的不斷增加，全球氣候的變暖，世界干旱地區(qū)的面積將至少增加8%[2]。植物為應對干旱環(huán)境，植物體內(nèi)會發(fā)生多種生理生化反應，以保持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)。如葉片的光合作用和蒸騰作用，是評價植物耐旱性的兩個重要生理生態(tài)過程，干旱脅迫下，氣孔的開合是調(diào)節(jié)植物光合速率和蒸騰速率的主要途徑[3]。另外，植物可通過提高體內(nèi)的一些保護酶活性(如SOD、POD、CAT)，將體內(nèi)過多的活性氧加以清除，從而減少因活性氧攻擊細胞膜而產(chǎn)生的丙二醛含量；同時，干旱脅迫也會導致細胞內(nèi)脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量上升，從而使胞內(nèi)水勢降低，保持水分不流失[4～5]。另一方面，植物在分子水平上也會發(fā)生一系列反應，以響應干旱脅迫，如干旱相關基因表達水平的變化，導致蛋白質(zhì)水平發(fā)生改變，最終使植物的各個生物學過程與干旱脅迫處理前有所差異，以應對干旱環(huán)境[6]。然而，大部分干旱響應相關基因數(shù)量十分有限，基因的功能更未得到精確鑒定，植物干旱響應相關的基因信息仍然有限[7]。蛋白質(zhì)是生命活動的直接執(zhí)行者，由于從基因到蛋白質(zhì)，需要經(jīng)歷轉錄、轉錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾等過程，導致基因組、轉錄組與蛋白質(zhì)組之間存在信息差，從而影響細胞內(nèi)包括蛋白質(zhì)周轉、蛋白質(zhì)活性、蛋白質(zhì)定位等在內(nèi)的多種重要生物學過程[8]。因此，比較蛋白質(zhì)組學技術在植物干旱應答機制研究中的廣泛應用，可對其分子機制的進行深度解析[8]。

杜仲是中國特有的落葉喬木，屬杜仲科杜仲屬。杜仲皮和葉干燥以后，可以入藥，是一種名貴中藥材，同時也是工業(yè)橡膠的原料。杜仲在我國分布廣泛，由于其主根深、側根發(fā)達、須根系龐大等特點，具有較強的水土保持能力。因此是山區(qū)發(fā)展經(jīng)濟林的重要樹種，同時可以用于綠化和水土保持，特別是陜北黃土丘陵區(qū)[9]。當前，對杜仲的研究，主要集中在其藥理作用、成分分析、栽培管理等方面，對干旱脅迫下杜仲的生理生化響應機制也有涉及，如干旱脅迫對杜仲葉片光合作用、水飽和虧、過氧化物酶活性等的影響研究[3～5]。但是，對于干旱脅迫下杜仲的分子響應機制研究較少，對于杜仲干旱響應關鍵蛋白的篩選和鑒定的研究更是鮮有報導。因此，本研究擬對干旱脅迫下的杜仲葉片差異蛋白質(zhì)組變化進行研究，同時分析干旱脅迫3、6、9、12、15 d以及復水后2 d葉片的光合特征、SOD活性、POD活性、CAT活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、丙二醛含量和水分飽和虧，以了解杜仲響應干旱脅迫的生理生化和分子機制，為利用杜仲的優(yōu)質(zhì)抗旱基因提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料的培養(yǎng)與處理

1.2 生理生化指標測定

1.2.1 葉片水分飽和虧

參照謝寅峰等[10]的方法進行。

1.2.2 光合參數(shù)的測定

利用Li-6400便攜式光合測定儀(美國LI-COR Biosciences公司)，測定不同處理時間下杜仲葉片的凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度、氣孔導度。光合有效輻射強度設定為1 400 μmol·m-2·s-1，光源為人工光源，使用空氣CO2濃度。

1.2.3 保護酶活性測定

超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)酶液的制備和酶活測定參照劉紅云等[4]的方法進行。

1.2.4 丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量測定

鑒于此，本研究針對紙漿洗滌過程的特點，充分利用生產(chǎn)過程長期運行積累的工業(yè)數(shù)據(jù)，基于兩步神經(jīng)網(wǎng)絡法得到殘堿和黑液波美度的預測模型，通過這兩大指標構建紙漿洗滌質(zhì)量評價模型，對工業(yè)運行數(shù)據(jù)進行聚類、模式匹配，構建出優(yōu)化模式庫。以最優(yōu)生產(chǎn)為目標，對優(yōu)化模式庫進行操作模式尋優(yōu)，匹配出最優(yōu)操作模式。通過實驗驗證該方法能有效預測紙漿洗滌過程的狀態(tài)參數(shù)，達到優(yōu)化生產(chǎn)的效果。

丙二醛含量測定參照Hodges等[11]的方法進行；脯氨酸含量測定參照Bates等[12]的方法進行；可溶性糖含量測定參照Farhad等[13]的方法進行。

1.3 杜仲葉片蛋白質(zhì)雙向電泳分離、差異蛋白MALDI-TOF-TOF生物質(zhì)譜鑒定

杜仲葉片總蛋白提取參照Liu等[14]的方法進行，將獲得的蛋白干粉溶解于適量的裂解緩沖液(7 mol·L-1尿素，2 mol·L-1硫脲、4% CHAPS、65 mmol·L-1Dithiothreitol(DTT)、微量蛋白質(zhì)抑制劑)中，置于冰上2 h，然后在4℃，19 000 g·min-1轉離心1 h，取上清。采用Liu等[14]的方法對上清液進行蛋白濃度測定。將獲得蛋白質(zhì)樣品進行雙向電泳分離，并對2-DE膠圖進行pdquest 8.0軟件分析，找出差異蛋白點，并對差異蛋白進行生物質(zhì)譜鑒定，操作步驟參考Liu等[14]的方法進行。參考的數(shù)據(jù)庫為NCBI綠色植物庫(taxid:33090；336070 protein sequences；20170113)，蛋白質(zhì)評分C.I.%超過95%以上的蛋白質(zhì)認定為鑒定成功的蛋白。

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫對杜仲葉片中生理生化指標的影響

極端干旱環(huán)境中的植物，如果長時間得不到水分補償，會導致長期水分虧缺，從而影響到植物的正常生理代謝活動。因此，水分飽和虧是反應植物對干旱耐受程度的重要指標。研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉片水飽和虧隨著水分脅迫處理時間的延長而增加，在處理第15 d時，水分飽和虧達到最大值，為55.19%，而復水后的水分飽和虧降為6.93%(表1)。結果表明，杜仲在持續(xù)性干旱脅迫下具有一定的自我調(diào)節(jié)能力。

由表1可以看出，隨干旱脅迫脅迫時間的延長，杜仲葉片的光合速率、蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度、氣孔導度均逐漸降低，特別是在干旱處理第15 d，杜仲葉片的光合速率、蒸騰速率、胞間二氧化碳濃度、氣孔導度平均值比對照(0 d)分別降低了86.78%、91.61%、76.00%、94.07%。結果表明，為適應水分虧缺環(huán)境，杜仲葉片的蒸騰耗水量顯著降低，同時，杜仲葉片的氣孔會關閉，使氣孔導度顯著降低，胞間二氧化碳濃度達不到光合作用所需，從而導致光合速率顯著下降，而且干旱脅迫時間越長，影響越大。因此，氣孔關閉是影響干旱脅迫下杜仲葉片光合作用和蒸騰作用的主要原因。

SOD、POD、CAT是生物體內(nèi)清除活性氧等自由基的重要保護酶，與植物耐旱性能呈正相關關系。研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉片中SOD、POD、CAT活性隨著干旱脅迫時間的延長，出現(xiàn)先上升后下降的趨勢，特別是在處理15 d時，3種保護酶活性顯著下降，表明持續(xù)干旱導致杜仲所受的傷害加重，超出自身耐受能力，并使保護酶活性下降，抗氧化能力減弱。復水后，與干旱處理15 d相比，杜仲葉片的保護酶活性下降。

丙二醛是細胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量越高，表明細胞受傷害程度越大。表1結果表明，在干旱處理前期(前6 d)，杜仲葉片中丙二醛含量逐漸上升，但是在處理第7～12 d，丙二醛含量呈下降趨勢，然而在處理第12天以后，丙二醛含量顯著上升。結果表明，干旱處理早期，杜仲葉片細胞膜系統(tǒng)受到損害，為減少傷害，杜仲自身會啟動保護酶防御系統(tǒng)， 因而在處理7～12 d時， 葉片丙二醛含量逐漸降低。但是在處理第12 d以后，干旱脅迫程度已經(jīng)超過杜仲自身的耐受限度，保護酶系統(tǒng)遭到破壞，增強了膜脂質(zhì)過氧化程度，導致丙二醛含量再次上升。在復水后，杜仲葉片中的丙二醛含量降低至28.73 mmol·g-1，仍維持在較高水平，表明持續(xù)性干旱脅迫已對杜仲造成不可修復的損傷。

表1 干旱脅迫下杜仲葉片生理生化指標測定結果

注：FW.鮮重；SOD.超氧化物歧化酶；POD.過氧化物酶；CAT.過氧化氫酶；MDA.丙二醛 數(shù)字右上方字母相同的，表示無顯著性差異，不同字母表示顯著性差異，差異水平設置為P<0.05。

Note：FW. Fresh weight；SOD. Superoxide dismutase；POD. Peroxidase；CAT. Catalase；MDA. Malondialdehyde Mean values with the same letters in the same indices indicate non-significant difference,and means with different letters show significant difference atP<0.05 level.

通常情況下，干旱處理后的植物組織細胞中，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性糖含量會顯著上升，以降低胞內(nèi)滲透勢從而減少水分損失。從表1中可以看出，杜仲葉片中脯氨酸和可溶性糖含量在干旱處理前期，含量逐漸上升，在處理第12 d時達到最大值，分別為151.48 μg·g-1、14.71%，結果表明，杜仲葉片可以通過提升胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)脯氨酸和可溶性糖含量來應對干旱脅迫。但是在干旱脅迫處理第15 d時，兩者含量顯著下降，表明杜仲的干旱耐受能力有限，超過一定的時期，會造成杜仲不可逆轉的損傷。在復水后，杜仲葉片中脯氨酸和可溶性糖水平下降，但是仍不能恢復到處理前(0 d)水平。

2.2 干旱脅迫對杜仲葉片中蛋白質(zhì)組的影響

各種生理指標測定結果表明，杜仲葉片在干旱處理第15天時呈現(xiàn)最大傷害程度，為解析杜仲葉片在此條件下的分子響應機制，將0 d和處理15 d的杜仲葉片的蛋白質(zhì)，通過雙向電泳分離，分別檢測到594、617個重復性較好的蛋白點(圖1)，其中1.5倍以上的差異表達蛋白點有36個(P<0.05)。經(jīng)MALDI-TOF-TOF生物質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫比對，36個差異蛋白點均被鑒定成功，其中22個蛋白點豐度在干旱處理后上升，14個蛋白點豐度下降(表2)。通過功能富集分析，這些差異蛋白質(zhì)涉及干旱脅迫信號感應和傳導、光合作用、碳水化合物代謝、次生代謝物的合成、氨基酸生物合成、能量代謝、蛋白質(zhì)生物合成，以及活性氧等自由基清除等(圖2:A)，其中上調(diào)表達的蛋白質(zhì)主要參與信號傳導、碳水化合物代謝、能量代謝、活性氧清除、氨基酸生物合成，光合作用、蛋白質(zhì)生物合成、次生代謝物的合成等生物學過程相關蛋白則下調(diào)表達(表2)。從亞細胞定位結果可知，所鑒定的差異蛋白大部分定位于葉綠體(55%)中，其次是細胞質(zhì)中(31%)(圖2:B)，表明光合作用相關蛋白受干旱脅迫影響最大。

圖2 干旱脅迫下杜仲葉片差異蛋白的功能分類及亞細胞定位結果 A.差異蛋白的功能分類；B.差異蛋白的亞細胞定位Fig.2 Distribution representation of the identified proteins based on their function and subcellular localizationA.Function classification of the differential expressed proteins; B.Subcellular localization of the differential expressed proteins

點編號Spot No.蛋白描述Protein Description登錄號Accession物種Species蛋白得分Protein score實驗值Experimental理論值Theoretical分子量Mass(kDa)等電點pI分子量Mass(kDa)等電點pIFCPMCR1核糖體蛋白L22ribosomal protein L22ANP25540.1杜仲E.ulmoides37959.215.1654.7910.06-3.1843592ATP合酶CF1 α亞基ATP synthase CF1 alpha subunitANP25499.1杜仲E.ulmoides21853.625.1855.195.342.2423483黃酮醇合酶flavonol synthasegi|477542029杜仲E.ulmoides18641.075.5238.035.59-2.5228534ATPase α亞基ATPase alpha subunitgi|89112874杜仲E.ulmoides19148.136.0446.226.214.72244553-羥基-3-甲基戊二烯輔酶A合酶3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthasegi|1160524372杜仲E.ulmoides15250.715.2551.695.77-2.2120626Rubisco大亞基ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunitgi|1041926818杜仲E.ulmoides11252.896.1853.346.33-2.0134717乙酰輔酶A乙酰轉移酶acetyl-CoA acetyltransferasegi|1160524370杜仲E.ulmoides20835.215.1442.948.92-2.6118428乙酰輔酶A乙酰轉移酶acetyl-CoA acetyltransferasegi|1160524370杜仲E.ulmoides10229.595.2142.948.92-3.428279光捕獲類蛋白3light harvesting-like protein 3gi|290782564杜仲E.ulmoides9812.365.929.126.38-1.72919101-脫氧基-D-5-磷酸核酮糖合酶1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthasegi|408833344杜仲E.ulmoides10466.485.8776.968.14-3.13122111S-腺苷甲硫氨酸合酶3S-adenosylmethionine synthase 3gi|743783202胡楊Populus euphratica17834.605.4743.245.502.33205212磷酸甘油酸激酶phosphoglycerate kinaseXP_016702717.1陸地棉Gossypium hirsutum23150.174.2951.238.742.25112113谷氨酰胺合成酶glutamine synthetase leaf isozymegi|255551511蓖麻Ricinus communis35251.086.4949.846.574.871324142磷酸核酮糖脫羧/加氧酶活化酶ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase,chloroplastic isoform X2gi|747060719芝麻Sesamum indicum13546.046.3247.606.78-2.93235115RNA聚合酶α鏈RNA polymerase alpha chaingi|1041926828杜仲E.ulmoides10632.836.5637.556.51-1.93142616烯醇酶Enolasegi|743896837胡楊P.euphratica11044.385.1947.915.675.53111917磷酸甘油酸變位酶2,3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutasegi|922339631蒺藜狀苜蓿Medicago truncatula20247.035.0250.575.452.52216218生長素結合蛋白1auxin-binding protein 1gi|46409853杜仲E.ulmoides16025.015.8821.455.663.82183719富胚胎發(fā)育晚期蛋白Dc3late embryogenesis abundant protein Dc3gi|702484246巨桉Eucalyptus grandis25514.216.5314.106.164.3994520Rubisco大亞基ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,partialgi|766946891杜仲E.ulmoides18432.174.3429.239.1610.85132821Rubisco大亞基ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit,partialgi|343186353杜仲E.ulmoides26220.105.5421.985.783.61163722鐵氧還蛋白-NADP還原酶ferredoxin-NADP reductasegi|1000938423蓖麻R.communis25840.624.8840.858.80-2.841843232-磷酸果糖醛縮酶1fructose-bisphosphate aldolase 1gi|743793523胡楊P.euphratica11955.126.1242.868.132.76133524光系統(tǒng)IIcp47蛋白photosystem II cp47 protein,partialgi|335060099杜仲E.ulmoides9460.156.7568.326.64-4.9282325過氧化物酶aperoxidase agi|51511062杜仲E.ulmoides23536.144.7336.018.108.531443

續(xù)表2Continuedtable2

點編號Spot No.蛋白描述Protein Description登錄號Accession物種Species蛋白得分Protein score實驗值Experimental理論值Theoretical分子量Mass(kDa)等電點pI分子量Mass(kDa)等電點pIFCPMCR26磷酸丙糖異構酶triosephosphate isomerasegi|1002246204甜椒Capsicum annuum27729.125.2427.095.722.71185427L-抗壞血酸過氧化物酶L-ascorbate peroxidasegi|823153064雷蒙德氏棉Gossypium raimondii14527.895.3527.535.593.01125328磷酸核酮糖激酶Phosphoribulokinasegi|743809191胡楊P.euphratica15542.765.6244.966.032.55226429甘氨酸脫氫酶glycine dehydrogenasegi|823234381雷蒙德氏棉G.raimondii397110.286.27113.926.505.81295830β-葡糖苷酶12類前體beta-glucosidase 12-like precursorgi|658309748蘋果Malus domestica17862.145.4860.905.564.372853316-磷酸葡萄糖脫氫酶glucose-6-phosphate dehydrogenaseBAK22407.1本氏煙Nicotiana benthamiana9560.056.1758.596.09-3.18132932碳酸酐酶carbonic anhydrase,chloroplastic isoform X3gi|1111061574野生煙草Nicotiana attenuate17625.526.0129.195.922.84164933抗壞血酸過氧化物酶1cytosolic ascorbate peroxidase 1gi|148912162陸地棉G.hirsutum11226.615.7527.595.933.12114334RNA結合蛋白CP31BRNA-binding protein CP31BJAU51823.1天藍遏藍菜Noccaea caerulescens11929.884.8132.704.82-3.331459352-Cys過氧化物還原酶BAS12-Cys peroxiredoxin BAS1gi|255578581蓖麻R.communis9641.514.7129.308.385.0274736[Cu-Zn]超氧化物歧化酶superoxide dismutase[Cu-Zn]gi|747082905芝麻S.indicum10523.175.8222.865.892.881053

注：FC.變化倍數(shù)；PM.匹配肽段數(shù)；CR.覆蓋率

Note：FC.Fold Change；PM.Peptides matched；CR.Coverage rate

3 討論

3.1干旱脅迫下杜仲葉片生理生化變化

研究發(fā)現(xiàn)，在水分飽和虧達到46.2%時，杜仲葉片會發(fā)生萎蔫現(xiàn)象，而達到50%以上，則可發(fā)現(xiàn)葉片枯黃，表明此時干旱脅迫已對杜仲產(chǎn)生重度干旱脅迫[4]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱處理15 d后的杜仲葉片，水分飽和虧達到55.19%(表1)，表明此時，干旱脅迫已導致杜仲葉片重度干旱損傷。差異蛋白質(zhì)組學研究亦選取此時的葉片進行研究，以篩選和分析重度干旱脅迫下杜仲葉片干旱脅迫響應相關蛋白及其機制。

隨著干旱處理時間的延長，對杜仲造成的脅迫程度加劇，葉片凈光合速率和蒸騰速率均以對照(0 d)為最大。氣孔導度和胞間二氧化碳濃度也隨著干旱脅迫時間的延長而逐漸顯著降低(表1)。氣孔的關閉是通過調(diào)節(jié)葉片氣孔保衛(wèi)細胞的運動來實現(xiàn)的[3]，由表1結果表明，杜仲為適應干旱環(huán)境，植株會降低氣孔導度，降低CO2的交換速度和濃度，維持較低的光合速率和蒸騰速率，從而降低能量和水分的損耗。因此，氣孔限制是影響干旱脅迫下杜仲葉片光合作用的主要原因。

正常的植株體內(nèi)，活性氧等自由基的含量水平處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)，在逆境脅迫中，活性氧還能起到信號傳導的作用，然而，若過度的逆境脅迫，將會破壞自由基的平衡狀態(tài)，從而攻擊細胞膜、蛋白質(zhì)、核酸等，造成植物組織細胞因代謝紊亂而損傷[3]。活性氧的清除，需要依靠一些抗氧化保護酶如SOD、POD、CAT等的作用[3]。丙二醛是細胞膜脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，其含量高低可以反映逆境脅迫導致膜損傷的程度[15]。在干旱處理前期(6 d)，杜仲葉片中丙二醛含量逐漸上升，表明抗氧化酶還未完全發(fā)揮作用，雖然SOD、POD、CAT活性從干旱處理開始就逐漸上升(表1)。但是在處理第7～12 d，丙二醛含量逐漸下降，表明抗氧化保護酶已發(fā)揮其作用，尤其是POD和CAT的活性，分別由處理前的482.59和229.61 U·g-1·min-1增加至2 847.26和4 234.35 U·g-1·min-1(表2)。這一結果與Ge等[16]、劉紅云等的結果一致[3]。

滲透調(diào)節(jié)是植物抵御逆境脅迫的一種重要方式，不同植物物種，因為基因型、蛋白譜等的差異，在響應逆境脅迫過程中，細胞內(nèi)累積的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)也不一致[17]。研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性干旱脅迫導致杜仲葉片中脯氨酸和可溶性糖含量顯著上升，在復水后，含量有所下降(表1)。結果表明，脯氨酸和可溶性糖是杜仲葉片中重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以降低其在干旱環(huán)境中的水分損失，從而維持植物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這與劉紅云等[3]的研究結果類似。

3.2 干旱處理對杜仲葉片蛋白質(zhì)的影響

根據(jù)逆境脅迫的強度和持續(xù)時間，可將植物響應逆境脅迫過程分為四個階段[18]：起始預警階段(initial alarm phase)，該階段會導致植物的快速應激反應，使植物的抗逆能力下降；第二階段為適應階段(acclimation phase)，并持續(xù)數(shù)天，此時植物會發(fā)生各種生理生化代謝反應，以建立一個新的內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)；第三階段為維持期(maintenance phase)，新建立的內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)在該階段會維持在一個較穩(wěn)定的水平；如果逆境脅迫強度過大或者持續(xù)時間過長，植物無法維持其建立的新的內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)，將會進入衰退期(recession phage)，導致植物各種生物學代謝過程紊亂。每一個階段對應植物不同的蛋白質(zhì)組成[19]。

3.2.1 干旱對杜仲葉片信號轉導相關蛋白的影響

植物響應干旱脅迫的第一步是感應和傳導脅迫信號，繼而引發(fā)植物響應逆境脅迫的四個反應階段。在干旱處理后的杜仲葉片中，有2個蛋白涉及信號傳導，即生長素結合蛋白1(ABP1，蛋白點18，表2)和β-葡糖苷酶12類前體(蛋白點30)，ABP1蛋白定位于細胞壁，并在逆境脅迫中起到信號傳導的作用[20]。ABP1基因在干旱脅迫下的玉米中的上調(diào)表達，可使玉米生長受限，以抵御缺水環(huán)境[21]。葡糖苷酶在逆境脅迫中可以通過生氰作用，催化葡萄糖苷的水解，繼而激發(fā)各種活性激素的產(chǎn)生，包括細胞激素、赤霉素和生長素，從而將逆境信號傳遞至胞內(nèi)[22]。ABP1和葡糖苷酶在干旱處理后的杜仲葉片中上調(diào)表達，表明杜仲可通過調(diào)控葉片中生長素水平，調(diào)節(jié)植物生長以適應干旱缺水環(huán)境。

3.2.2光合作用、碳代謝、能量代謝相關蛋白在干旱處理的杜仲葉片中的變化

光合作用是植物體內(nèi)碳水化合物合成的主要生物學過程，對植物細胞生長和增殖及其重要，主要包括兩個反應階段，即光反應階段(光捕獲)和暗反應階段(卡爾文循環(huán))，保持穩(wěn)定光合速率對維持植物在逆境脅迫中的生長具有重要意義[14]。本研究發(fā)現(xiàn)共有7個蛋白參與干旱脅迫下杜仲葉片的光合作用(表2)，其中2個上調(diào)表達(蛋白點20與21)，5個下調(diào)表達(蛋白點6、9、14、22、24)。光捕獲蛋白3(蛋白點9)、NADPH-鐵氧還蛋白還原酶(蛋白點22)與光系統(tǒng)IIcp47蛋白(蛋白點24)參與光反應階段，其中NADPH-鐵氧還蛋白還原酶可催化電子從NADPH轉移至鐵氧還蛋白的反應，并產(chǎn)生質(zhì)子(H+)和電子勢，是光合反應過程的限速步驟之一[14]。這三個蛋白在干旱脅迫下的杜仲葉片中下調(diào)表達(表2)，表明持續(xù)性干旱脅迫已導致杜仲葉片光合電子傳遞鏈受到顯著抑制，從而導致過量的激發(fā)態(tài)能量被轉移至活性氧的產(chǎn)生過程，從而導致氧化脅迫，這與Ghosh等[23]的推論一致。其余的4個蛋白點主要參與碳固定(卡爾文循環(huán))階段，包括1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶大亞基(Rubisco，蛋白點6,20,21)與1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶活化酶(Rubisco活化酶，蛋白點14)。Rubisco可以催化CO2與二磷酸核酮糖反應形成3-磷酸甘油酸，繼而起始碳水化合物代謝反應，其中CO2是加氧反應的競爭性抑制子，而O2則是羧化反應的競爭性抑制子[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白點6的分子量(52.89 kDa)要顯著大于蛋白點20(32.17 kDa)和蛋白點21(20.10 kDa)，而蛋白點6在干旱脅迫后的杜仲葉片中下調(diào)表達，蛋白點20與21則上調(diào)表達，表明蛋白點20與21是蛋白點6的降解片段，Rubisco酶在持續(xù)性干旱脅迫后的杜仲葉片中遭到破壞，影響杜仲葉片的光合作用，這與楊樹葉片響應干旱脅迫的機制一致[24]。Rubisco活化酶基因通過可變剪輯，可表達形成兩種亞型，且起不同作用的蛋白，它們的分子量分別在41～43與45～46 kDa，分子量較大的亞型主要通過調(diào)節(jié)細胞基質(zhì)中氧化還原態(tài)，調(diào)控逆境脅迫中植物的光合作用，而小亞型則通過保持逆境脅迫下植物中Rubisco活性來適應脅迫環(huán)境[25]。本研究中Rubisco活化酶(蛋白點14)的分子量為46.06，屬分子量較大的亞型，它的下調(diào)表達表明持續(xù)性干旱導致杜仲葉片氧化還原穩(wěn)態(tài)遭到破壞，使其光合作用受到抑制。在生理生化指標分析過程中，也發(fā)現(xiàn)干旱處理可導致杜仲葉片氣孔的關閉，降低蒸騰作用，減少水分損失，同時葉片對外界CO2的吸收也降低，最終導致杜仲葉片光合速率降低(表1)。綜上所述，持續(xù)性干旱缺水環(huán)境，導致Rubisco酶和Rubisco活化酶活性受到影響，并抑制杜仲葉片光合作用。

碳水化合物代謝是繼光合作用以后，最易受干旱影響的生物學過程，它包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑。糖酵解/糖質(zhì)新生可將葡萄糖轉化為丙酮酸和H+，并將產(chǎn)生的能量以ATP和NADH的形式儲存；三羧酸循環(huán)是將丙酮酸在有氧的情況下降解形成CO2和水，并產(chǎn)生能量ATP供植物正常生長和分化所需，同時，也可產(chǎn)生一些體內(nèi)物質(zhì)合成過程中所需的前體物質(zhì)；磷酸戊糖途徑是糖酵解途徑中的一個旁路，產(chǎn)生5-磷酸核糖和NADPH，為代謝物生物合成提供基體物質(zhì)和還原力[26]。本研究供發(fā)現(xiàn)有6個蛋白參與糖酵解途徑，其中5個蛋白在干旱處理后的杜仲葉片中上調(diào)表達，包括磷酸甘油酸激酶(蛋白點12)、烯醇酶(蛋白點16)、磷酸甘油酸變位酶(蛋白點17)、二磷酸果糖醛縮酶1(蛋白點23)、磷酸丙糖異構酶(蛋白點26)，只有一個蛋白下調(diào)表達，即6-磷酸葡萄糖激酶(蛋白點31)。另外，有1個蛋白參與杜仲葉片的磷酸戊糖途徑，且在干旱處理后上調(diào)表達，磷酸核酮糖激酶(蛋白點28)。本次實驗沒有發(fā)現(xiàn)三羧酸循環(huán)相關蛋白。結果表明，持續(xù)性干旱脅迫下的杜仲葉片中，糖酵解和磷酸戊糖途徑得到增強，這可能是杜仲葉片中可溶性糖含量在干旱處理后上升(表1)的主要原因。

糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑伴隨著能量的代謝。本研究共發(fā)現(xiàn)有2個能量代謝相關蛋白，包括ATP合酶CF1α亞基(蛋白點2)和ATPaseα亞基(蛋白點4)，它們在干旱脅迫后的杜仲葉片中含量上升。ATPase是質(zhì)膜和細胞器內(nèi)膜系統(tǒng)的內(nèi)嵌蛋白，包括Na+、K+、H+-ATPase，是植物體內(nèi)能量代謝的關鍵酶；ATP合酶CF1α亞基是線粒體內(nèi)Ca2+結合型的特異性蛋白，其產(chǎn)生的ATP作為能量物質(zhì)，可維持膜上鈣泵活性所需，并可調(diào)節(jié)細胞質(zhì)中Ca2+濃度[27]。能量代謝相關蛋白的上調(diào)表達，表明杜仲葉片在干旱脅迫下能量代謝得到增強。

綜上所述，持續(xù)性干旱脅迫對杜仲葉片的光合作用產(chǎn)生負面影響，但是可以通過糖酵解途徑和磷酸戊糖途徑生產(chǎn)的ATP、NADPH等能量物質(zhì)，以維持其在干旱環(huán)境中的生長所需。

3.2.3干旱脅迫下杜仲葉片次級代謝物合成相關蛋白的變化

杜仲葉中富含萜類物質(zhì)，是杜仲膠的主要成分，細胞質(zhì)的甲羥戊酸(Mevalonate,MVA)途徑和質(zhì)體的脫氧木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway，DXP)途徑是萜類物質(zhì)合成的兩個重要途徑[28]。在MVA途徑中，乙酰輔酶A?；D移酶(蛋白點7與8)是其中的一個關鍵酶，屬Ⅱ型硫解酶[29]，它們在干旱處理后的杜仲葉片中下調(diào)表達(表2)。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶(蛋白點5)是MVA途徑的另一關鍵限速酶，它可催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A，然后經(jīng)3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶的催化作用，形成甲羥戊酸[28]，缺水處理同樣導致3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合酶在杜仲葉片中的表達量下降(表2)。脫氧木酮糖-5-磷酸合酶(蛋白點10)是DXP合成過程中的關鍵酶，然后經(jīng)2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸(MEP)途徑合成帖類物質(zhì)[30]，該酶在干旱處理后的杜仲葉片中的表達比對照下降3.13倍(表2)。結果表明，干旱處理導致杜仲葉片的萜類物質(zhì)的合成受限，引起了杜仲的中藥成分變化。

黃酮類化合物是一類具有抗氧化、抗腫瘤活性的多酚類次級代謝物，廣泛存在于植物中，黃酮醇是其中較重要的一種，包括槲皮素、山奈酚和楊梅素均屬于黃酮醇，黃酮醇合成酶(蛋白點3)是黃酮醇合成途徑中的關鍵酶[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理15天以后，杜仲葉片中的黃酮醇合成酶下調(diào)表達(表2)。結果表明，在缺水環(huán)境中的杜仲葉片中，黃酮醇類物質(zhì)合成受限。

3.2.4 干旱脅迫對杜仲葉片抗氧化保護酶的影響

活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)包含超氧化物陰離子自由基、羥基自由基、單線態(tài)氧、過氧化氫等，在逆境脅迫下，植物會產(chǎn)生過量的ROS，并引發(fā)氧化脅迫，攻擊細胞膜導致脂質(zhì)過氧化，并導致植物逆境脅迫損傷[22]，因此，干旱處理后的杜仲葉片丙二醛含量會上升(表1)。ROS也會攻擊蛋白質(zhì)使其降解，比如干旱脅迫后的杜仲葉片Rubisco(蛋白點6)被降解成小片段(蛋白點20與21)，從而抑制了杜仲葉片的光合作用(表1)。植物體一般會通過改變一些過氧化保護酶的表達量和活性，將過量ROS加以清除[22]，比如過氧化物酶a(蛋白點25)、L-抗壞血酸過氧化物酶(蛋白點27)、碳酸酐酶(蛋白點32)、胞質(zhì)抗壞血酸過氧化物酶1(蛋白點33)、2-Cys過氧化物氧化還原酶(蛋白點35)、[Cu-Zn]超氧化物歧化酶(蛋白點36)，這些蛋白質(zhì)在干旱處理的杜仲葉片中均上調(diào)表達(表2)。另一方面，生理指標結果表明，杜仲葉片中SOD、POD和CAT的活性，在干旱處理后增強(表1)。結果表明，杜仲葉片可以通過增加過氧化保護酶的表達量和活性來抵御干旱。

3.2.5干旱脅迫對杜仲葉片氨基酸和蛋白生物合成的影響

提升植物細胞內(nèi)游離氨基酸含量是植物適應逆境脅迫的一個重要機制，因為氨基酸可以作為一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，因此，氨基酸合成相關酶的調(diào)控對植物適應干旱環(huán)境極其重要[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，在干旱處理15 d后的杜仲葉片中，氨基酸合成相關蛋白均上調(diào)表達(表2)，包括S-腺苷甲硫氨酸合成酶3(蛋白點11)、谷氨酰胺合成酶(蛋白點13)、甘氨酸脫氫酶(蛋白點27)。其中谷氨酰胺合成酶在氮代謝過程中起著關鍵作用，且與植物體內(nèi)脯氨酸水平調(diào)節(jié)緊密相關[14]，它在干旱脅迫下杜仲葉片中的上調(diào)表達，與杜仲葉片脯氨酸含量上升(表1)的結果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)4個蛋白與蛋白質(zhì)代謝相關，包括核糖體蛋白L22(蛋白點1)、RNA聚合酶α鏈(蛋白點15)、胚胎發(fā)育晚期蛋白Dc3(LEA Dc3，蛋白點19)、RNA結合蛋白CP31B(蛋白點34)。根據(jù)這些蛋白的分子功能，可將其歸為兩類蛋白，即蛋白質(zhì)生物合成表達相關蛋白(蛋白點1、15和34)和分子伴侶蛋白(蛋白點19)，這兩類蛋白在干旱處理后的杜仲葉片中分別表現(xiàn)為下調(diào)表達和上調(diào)表達，表明干旱處理導致蛋白質(zhì)的生物合成受到抑制，但是仍需要發(fā)揮分子伴侶蛋白的功能，以維持某些蛋白質(zhì)的正常結構，保持其活性。

4 結論

通過生理生化指標分析和蛋白質(zhì)組學差異研究，杜仲可以通過提升信號傳導、碳水化合物代謝途徑、能量代謝、氨基酸合成和抗氧化相關蛋白的表達，同時增加脯氨酸含量、可溶性糖含量以及氧化保護酶活性，以增強杜仲的抗旱能力；另一方面，持續(xù)性干旱脅迫通過降低杜仲葉片光合作用、次級代謝物合成、蛋白質(zhì)的生物合成相關蛋白的表達，使這些生物學過程在干旱處理后受到限制。研究結果可為揭示杜仲響應干旱脅迫的分子機制奠定基礎。

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