HPLC法測定檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的含量

李春燕，張學(xué)敏，岳璐，閆福林*(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453002)

檳榔為棕櫚科植物檳榔ArecacatechuL. 的干燥成熟種子，廣泛栽培于中國、印度、印度尼西亞、斯里蘭卡、菲律賓等南亞及東南亞國家[1]。中醫(yī)認(rèn)為檳榔性溫，味辛、苦，歸胃、大腸經(jīng)，具有驅(qū)蟲消積、行氣利水、截瘧的功效，檳榔堿是檳榔中的主要活性成分，其他生物堿還有檳榔次堿、去甲基檳榔次堿等[1-3]。

目前測定檳榔堿含量的方法主要有HPLC、薄層掃描法、毛細(xì)管電泳法和酸堿滴定法等[2,4-6]，而對檳榔次堿的含量測定方法尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文建立了采用反相高效液相色譜測定檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的分析方法，該方法簡便易行，靈敏可靠，可用于測定檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的含量 。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent1100高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；電子天平(萬分之一，MS204S型，瑞士Mettler Toledo公司)；電子天平(十萬分之一，萬分之一，XS205型，瑞士Mettler Toledo公司)；微量高速離心機(jī)(TG-16W型，長沙湘儀)；上海雷磁公司pH-25型pH計(jì)；德國MN Nucleosil SA陽離子交換色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。

1.2 試藥

氫溴酸檳榔堿(供含量測定用)，中國藥品生物制品檢定所提供；鹽酸檳榔次堿(供含量測定用)，購于SIGMA公司；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 方法及結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Nucleosil SA陽離子交換色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相為甲醇-水-磷酸(60∶40∶0.3, 氨試液調(diào)pH3.8)，檢測波長：212 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

分別取檳榔堿和檳榔次堿對照品適量，精密稱定，加40%甲醇溶解并制成每1 mL約0.5 mg的溶液，作對照品儲備液，在-20℃下保存?zhèn)溆?。分別精密量取對照品儲備液適量，加40%甲醇制成每1 mL中含檳榔堿8 μg和檳榔次堿3 μg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取樣品粉末約3 g，置于50 mL錐形瓶中，精密加入0.001 mol·L-1磷酸溶液30 mL，回流30 min，濾過，取1 mL濾液加入1 mL 85%磷酸，用0.45 μm濾器濾過，收集濾液，取1 mL濾液于10 mL容量瓶中加入40%甲醇溶液稀釋，加入25%氨水500 μL，40%甲醇定容，搖勻，備用。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗(yàn)

分別取對照品溶液和供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1，表明其他組分對檳榔堿和檳榔次堿測定無干擾。

圖1 HPLC色譜圖注：A.對照品,B.供試樣品；a.檳榔次堿，b.檳榔堿

2.3.2 線性關(guān)系

取檳榔堿對照品儲備液，搖勻，分別精密量取0.4，0.8，1.6，2.4，4.8 mL，置100 mL棕色量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別依法進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程為Y=0.049 5X+1.388 1，R2=0.999 5(n=5)，結(jié)果表明，檳榔堿在2.02～32.30 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈很好的線性關(guān)系。

取檳榔次堿對照品儲備液，搖勻，分別精密量取0.2，0.4，0.8，1.6，2.4 mL，置100 mL棕色量瓶中，加40%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別依法進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，計(jì)算線性回歸方程為Y=0.045 1X+0.128 3，R2=0.999 3(n=5)，結(jié)果表明，檳榔次堿在0.85～13.55 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)呈很好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

精密量取對照品儲備液適量，制成每1 mL中約含檳榔堿8 μg和檳榔次堿3 μg的對照品溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，檳榔堿和檳榔次堿峰面積的RSD依次為0.48%和0.67%，結(jié)果表明，本法進(jìn)樣的精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一樣品，按“3.2供試品溶液的制備”項(xiàng)下方法，平行制備6份供試品溶液，依次進(jìn)樣，6份供試品中檳榔堿和檳榔次堿峰含量的RSD為2.79%和3.01%。結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對照品溶液和供試品溶液，室溫下放置0，2，4，8，12，24 h，分別進(jìn)樣，檳榔堿和檳榔次堿峰對照品溶液峰面積的RSD為1.87%和2.31%，供試品溶液中檳榔堿和檳榔次堿峰峰面積的RSD為2.18%和2.74%，結(jié)果表明，對照品溶液和供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好，滿足測定要求。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn)

精密量取檳榔堿和檳榔次堿對照品儲備液適量，加40%甲醇定量稀釋制成每1 mL中約含檳榔堿100 μg和檳榔次堿50 μg的工作溶液。取已測得含量的供試品溶液9份，精密稱定，精密加入0.5，1.0，1.5 mL上述工作溶液，按照含量測定法測定。檳榔堿的平均回收率為97.2%，RSD為2.4%(n=9)；檳榔次堿的平均回收率為103.9%，RSD為2.6%(n=9)。

2.4 樣品測定

取不同產(chǎn)地的10批樣品，照上述測定方法和色譜條件依法測定，樣品中檳榔堿和檳榔次堿含量測定結(jié)果如表1。

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的篩選

參照相關(guān)文獻(xiàn)[4,6]，選擇檢測波長為412 nm。分別比較了不同色譜柱Diamonsil C18色譜柱和Nucleosil SA陽離子交換色譜柱，并考察了流動相配比以及柱溫為30℃、35℃和40℃時(shí)的分離情況，在滿足檳榔堿和檳榔次堿與雜質(zhì)峰基線分離的前提下，并使待測物質(zhì)色譜峰峰形良好的情況下，最好選擇色譜條件為色譜柱為Nucleosil SA陽離子交換色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流動相為甲醇-水-磷酸(60∶40∶0.3, 氨試液調(diào)pH3.8)，檢測波長：212 nm，流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30℃。

表1 樣品中檳榔堿和檳榔次堿含量測定結(jié)果(mg/g)

3.2 樣品前處理方法的篩選

分別比較了不同溶劑體系：(1)甲醇，(2)40%甲醇，(3)20%甲醇，以及回流時(shí)間20 min、30 min和60 min，結(jié)果表明采用回流30 min的提取效果良好，可以用于本方法體系的含量測定。

3.3 檳榔產(chǎn)地分析

本文所分析的10批檳榔樣品中，檳榔堿含量均高于0.20%，符合2015版中國藥典檳榔項(xiàng)下的要求，其中除安徽產(chǎn)的檳榔中檳榔堿含量稍低外，其他產(chǎn)地的檳榔中檳榔堿的含量無顯著性差異。由于檳榔次堿也是檳榔中的重要活性成分之一，本方法同時(shí)測定了檳榔次堿的含量，在10批檳榔樣品中檳榔次堿的含量均高于0.05%，故建議藥典中應(yīng)列入檳榔次堿的含量測定項(xiàng)或相關(guān)質(zhì)量控制項(xiàng)，已便更好的控制檳榔質(zhì)量。

綜上所述，本文所建方法重復(fù)性好，回收率高，能準(zhǔn)確測定檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的含量，為檳榔質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供了參考。

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