惠州地區(qū)羅非魚細菌性疾病病原鑒定及藥敏分析

■ 王賀 （惠州市海洋技術(shù)中心，廣東 惠州 516001）

李慶勇（惠州市漁業(yè)研究推廣中心，廣東 惠州 516001）

惠州是水產(chǎn)養(yǎng)殖大市，全市水產(chǎn)養(yǎng)殖面積51萬畝，其中海水養(yǎng)殖12萬畝，淡水養(yǎng)殖39萬畝，羅非魚是目前惠州最主要的淡水魚類養(yǎng)殖品種。近年來，惠州羅非魚細菌性疾病多次爆發(fā)，導(dǎo)致大量羅非魚死亡，嚴重影響了惠州羅非魚產(chǎn)業(yè)乃至整個水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，十分有必要對羅非魚細菌性疾病的病原進行分子生物學(xué)鑒定并開展藥敏試驗，弄清惠州地區(qū)羅非魚細菌性疾病的致病原和敏感藥物，為羅非魚細菌性疾病的治療提供參考。與傳統(tǒng)的細菌鑒定相比，細菌的分子生物學(xué)鑒定具有快速、準確以及成本低等特點，且已經(jīng)建立了完善的鑒定方法步驟，對市級水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)人員比較適用。

1 材料與方法

1.1試驗材料

試驗菌株為2014-2017年在惠州轄區(qū)內(nèi)患病羅非魚體內(nèi)采集保存的菌株，共172株。腦心浸液培養(yǎng)基、血平板等微生物培養(yǎng)試劑耗材全部購自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；藥敏片為英國產(chǎn)OXOID品牌；分子鑒定試劑耗材購自大連寶生生物有限公司（TaKaRa）。

1.2 病原鑒定

革蘭氏染色初步判斷。按照DNA提取試劑盒說明書的方法提取細菌DNA作為模板，以1492r/F27為引物，進行PCR擴增（擴增條件為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30個循環(huán)，72℃延伸7min）。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定條帶后，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行序列測定，測序結(jié)果在GenBank上進行序列比對，進行16S rRNA的分子鑒定。

1.3 藥敏分析

根據(jù)已報道的文獻選取常用藥物紙片20種（表1）。挑取單克隆菌落接種至BHI液體培養(yǎng)基中，28℃搖床培養(yǎng)過夜培養(yǎng)，使用BioPhotometer plus測定菌液OD600數(shù)值，空白對照為同批次的滅菌BHI液體培養(yǎng)基。根據(jù)測得的OD600數(shù)值計算菌液濃度，然后使用無菌的BHI液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至1.5×108CFU/ml，移液器吸取調(diào)整后的菌液200μL于固體BHI平板，使用滅菌后的L型玻璃棒均勻涂布。待菌液稍晾干之后，使用鑷子貼上藥敏紙片，每個平板放置5～6種藥敏紙片，每一株分離菌株設(shè)置兩個平行實驗組，置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，28℃培養(yǎng)24h。然后用電子游標卡尺，測定抑菌圈大小，參照藥敏紙片產(chǎn)品說明書對菌株的藥物敏感性進行判定（表1）。

2 結(jié)果

2.1 鑒定結(jié)果

表1 藥敏紙片種類及判定標準

鑒定的172株菌株中，革蘭氏陽性菌（G+）153株，占89%；革蘭氏陰性菌（G-）19株，占11%。PCR結(jié)果顯示，擴增的片段在1,500bp處有明顯條帶（圖1）；經(jīng)測序并在GenBank上比對發(fā)現(xiàn)，無乳鏈球菌153株，嗜水氣單胞菌8株，遲緩愛德華氏菌3株，維氏氣單胞菌6株，類志賀鄰單胞菌2株。

2.2藥敏分析結(jié)果

藥敏分析結(jié)果顯示，菌種對不同藥物的敏感性不同（圖2），其中無乳鏈球菌主要對卡那霉素、慶大霉素、磺胺復(fù)合物、鏈霉素等耐藥，對氧氟沙星、四環(huán)素等敏感（見表2）。嗜水氣單胞菌主要對慶大霉素、磺胺復(fù)合物、四環(huán)素等耐藥，對恩諾沙星、強力霉素、氟苯尼考等敏感；維氏氣單胞菌對林可霉素、青霉素G、慶大霉素及氯霉素耐藥，對氧氟沙星、諾氟沙星、氟苯尼考等敏感；遲緩愛德華氏菌對磺胺復(fù)合物、四環(huán)素等耐藥，對恩諾沙星、氧氟沙星等敏感。

3 討論

2014～2017年采集保存的172株羅非魚致病菌中，無乳鏈球菌數(shù)量為153株，占總數(shù)的89%，說明近年來導(dǎo)致惠州羅非魚發(fā)生細菌性病的致病原主要為無乳鏈球菌，其他致病菌相對出現(xiàn)較少。但在采樣的過程中也發(fā)現(xiàn)，癥狀相似的患病羅非魚上分離到的致病菌并不屬于同一種菌。如眼球突出通常作為判斷羅非魚鏈球菌病的主要癥狀，但是在眼球突出的患病羅非魚體內(nèi)也分離到過單一的遲緩愛德華氏菌。因此，在日常的技術(shù)服務(wù)過程中，單靠經(jīng)驗或突出癥狀判斷羅非魚病因已經(jīng)不太準確。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段進行病原鑒定是較為準確快捷的一種方法。

表2 羅非魚源無乳鏈球菌分離菌株（153株）對20種藥物的藥敏試驗結(jié)果

圖1 部分菌株16S rRNA 擴增結(jié)果電

圖2 細菌藥敏試驗

在漁業(yè)生產(chǎn)實際活動中，養(yǎng)殖的水產(chǎn)動物一旦發(fā)病，養(yǎng)殖戶最迫切的需要是用藥指導(dǎo)，以減少養(yǎng)殖損失，因此，快速、簡便、科學(xué)、合理的用藥指導(dǎo)方法就顯得尤為重要。目前，藥敏分析是較為準確簡便的方法。在實際操作中，為盡快給予準確的用藥指導(dǎo)方案，可不用進行病原鑒定而直接進行藥敏分析，根據(jù)藥敏實驗結(jié)果為養(yǎng)殖戶提供快速的用藥指導(dǎo)意見，能大大縮短時間，最大限度減少養(yǎng)殖戶損失。