九香蟲血淋巴三種生物分子對胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖影響

曹米蘭，檀 軍，金道超，郭建軍

(貴州大學(xué) 昆蟲研究所/貴州山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

目前，惡性腫瘤已經(jīng)取代心腦血管疾病成為導(dǎo)致人類死亡的頭號殺手，而胃癌是消化系統(tǒng)最為常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤導(dǎo)致的男性死亡中位列第三，女性位列第五[1]。從天然動植物、微生物中提取針對腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性成分因其毒副作用小，綜合修復(fù)等功效一直是抗腫瘤藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一[2]。

藥用昆蟲是中國傳統(tǒng)中藥材的重要組成部分，據(jù)估計(jì)有1700多種傳統(tǒng)的中成藥處方配方中含有昆蟲成分或昆蟲提取物[3]。九香蟲(AspongopuschinensisDallas， 1851)是昆蟲綱半翅目兜蝽科傳統(tǒng)藥用昆蟲[4]，近代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)九香蟲具有抗腫瘤、溶解血栓、治療常見的消化道疾病及血管瘤等功效[5-7]，然目前國內(nèi)學(xué)者對九香蟲的研究多限于整蟲或粗提物的藥用療效，已確定的具體藥用成份及功效物質(zhì)并不多。

鑒于此，本研究采用不同技術(shù)手段，分離提取了九香蟲血淋巴中的小分子化合物、蛋白質(zhì)和多糖等大分子物質(zhì)，將其分別體外作用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞，使用MTT法檢測其對SGC-7901增殖抑制情況，初步確定了蛋白質(zhì)為抑制胃癌細(xì)胞增殖的主要活性物質(zhì)，為藥效成分的分離提取提供直接依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

九香蟲購自貴州省凱里市下司鎮(zhèn)(東經(jīng)107.80°，北緯26.52°)，活蟲置于-80℃冰箱冷凍備用。人胃癌SGC-7901細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑耗材

DMEM高糖培養(yǎng)基(美國HyClone公司)，胎牛血清(FCS，杭州四季青生物公司)，青鏈霉素混合液(100×)(北京Solarbio公司)，噻唑藍(lán)(3-(4，5-dimethyl thiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)(美國Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國Amresco公司)，Amicon Ultra-4超濾管(美國Millipore公司)，丙酮、無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BioTek公司)，高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，生物安全柜(瑞士ESCO公司)，冷凍干燥機(jī)(德國CHRIST公司)，電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1九香蟲血淋巴制備 取九香蟲活蟲置于-80℃冰箱冷凍，將冷凍后的九香蟲頭和翅膀掰掉，其余部分放于10 mL的注射器內(nèi)擠壓使其內(nèi)容物流入離心管中，內(nèi)容物液體4℃，12000 r/min離心30 min，取水溶性組分再次4℃，12000 r/min離心30 min，取上清液即制得九香蟲血淋巴。

1.4.2超濾分離小分子化合物 取九香蟲血淋巴適量按1∶4的比例稀釋，于4℃，12000 r/min離心30 min后取上清液。上清液轉(zhuǎn)移至50 mL潤濕的截留量為MWCO 3kDa的超濾管濾膜內(nèi)，置于高速冷凍離心機(jī)4℃，4500×g離心1 h，分別收集濾出液和濾膜內(nèi)溶液，小分子化合物富集于濾出液內(nèi)。濾出液置于液氮中速凍20 min，冷凍干燥備用。

1.4.3丙酮沉淀蛋白質(zhì) 配制濃度為20%、40%、60%和80%(W/V)的丙酮溶液各20 mL放入-20℃冰箱冷凍。取超濾后濾膜內(nèi)的血淋巴懸液4 mL平均分裝在4個15 mL離心管中，分別加入10 mL預(yù)冷的濃度為20%、40%、60%和80%的丙酮溶液，振蕩混合均勻，冰浴20 min?；旌弦?℃，3500×g離心20 min，棄上清，沉淀使用1 mL超純水溶解。上述步驟重復(fù)2次，蛋白沉淀使用超純水反復(fù)洗滌3-4次，置于液氮中速凍20 min，冷凍干燥備用。

1.4.4醇提法提取多糖 取超濾后濾膜內(nèi)的血淋巴懸液1 mL加入9 mL無水乙醇，振蕩混合均勻靜置5 min?；旌弦菏覝?，3500×g離心20 min，棄上清液。沉淀使用2 mL超純水溶解，室溫，3500×g離心20 min，吸取上清液加入9 mL無水乙醇，振蕩混合均勻，重復(fù)上述步驟2次。多糖提取液置于60℃電熱鼓風(fēng)干燥箱干燥，完全揮發(fā)掉水分和乙醇后，稱重備用。

1.4.5SGC-7901細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC-7901細(xì)胞使用含10%胎牛血清(FCS)，1%青鏈霉素混合液的DMEM(高糖)培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2濃度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，細(xì)胞鋪滿至細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部80%時(shí)進(jìn)行傳代，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.4.6MTT法檢測提取物對SGC-7901細(xì)胞增殖的影響 使用0.25%胰酶將處于對數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞消化下來，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，置于37℃，5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)實(shí)驗(yàn)組、無藥對照組(細(xì)胞組)及空白對照組。九香蟲血淋巴小分子物質(zhì)、不同濃度的丙酮溶液提取的蛋白質(zhì)、多糖提取物凍干粉分別稱重，使用DMEM培養(yǎng)基溶解，配制相同質(zhì)量濃度的供試樣品溶液。待細(xì)胞貼壁后，吸掉實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)液，分別加入供試樣品：小分子物質(zhì)、蛋白提取物、多糖提取物溶液，設(shè)置質(zhì)量濃度梯度為50、100、200 mg/L，每個濃度梯度設(shè)5個復(fù)孔。藥物作用48 h后，每孔加MTT(5 g/L)20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加200 μL二甲基亞砜(DMSO)，恒溫?fù)u床震蕩10 min以徹底溶解紫色結(jié)晶。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長檢測吸光度(A)值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(無藥組A值-空白組A值)×100%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度的丙酮對蛋白質(zhì)提取效率影響

各丙酮濃度提取的蛋白質(zhì)作用于SGC-7901細(xì)胞，經(jīng)MTT法檢測結(jié)果顯示，20%、40%、60%和80%(W/V)的丙酮提取的蛋白質(zhì)成分在不同的濃度梯度作用48 h對SGC-7901細(xì)胞增殖均有抑制作用。隨著丙酮濃度的增加，蛋白質(zhì)的提取效率增強(qiáng)，對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用也顯著增強(qiáng)，使用60%丙酮處理的血淋巴樣品與其他處理組相同作用濃度相比抑制率最高，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，當(dāng)樣品作用濃度為200 mg/L時(shí)抑制率最高為68.28%。同時(shí)相同質(zhì)量體積比的丙酮處理的九香蟲血淋巴隨著樣品作用濃度的增大，抑制

圖1 不同濃度丙酮處理九香蟲血淋巴作用48 h對SGC-7901細(xì)胞體外增殖影響Fig.1 The proliferation effects of A. chinensis haemolymph handled by acetone at different concentrations on SGC-7901 cells in vitro for 48 h

活性增強(qiáng)，呈一定的濃度依賴性關(guān)系，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)丙酮濃度增加到80%時(shí)，高劑量的丙酮對蛋白質(zhì)活性成分結(jié)構(gòu)和功能具有破壞作用，造成活性蛋白質(zhì)不可逆的變性失活，在相同作用濃度其對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制作用顯著低于20%、 40%、60%丙酮處理的血淋巴樣品，當(dāng)樣品作用濃度為100 mg/L時(shí)抑制率最高為16.30%。因此，60%丙酮溶液處理的九香蟲血淋巴可達(dá)到最高的蛋白質(zhì)提取效率，選擇這一處理組的蛋白質(zhì)提取物與其他成分進(jìn)行活性比較。

2.2 MTT法檢測九香蟲血淋巴三種成分對SGC-7901細(xì)胞增殖影響

使用超濾分離小分子化合物，60%(W/V)丙酮提取蛋白質(zhì)成分，醇提法提取多糖成分，三種成分分別作用于SGC-7901細(xì)胞48 h，通過MTT法檢測各樣品對胃癌SGC-7901細(xì)胞的體外增殖影響，結(jié)果如表1，圖2所示。其中蛋白質(zhì)提取物和小分子物質(zhì)作用48 h各濃度梯度對SGC-7901細(xì)胞增殖均具有抑制作用，表現(xiàn)出一定的濃度依賴性關(guān)系，且在較高的作用濃度條件下，蛋白質(zhì)提取物的增殖抑制活性顯著高于小分子物質(zhì)(P<0.05)，表明蛋白質(zhì)成分具有較高的抑制胃癌細(xì)胞增殖活性。多糖提取物各作用濃度與無藥對照相比均無明顯的抑制活性(P>0.05)，且隨著樣品濃度的增加抑制率逐漸降低，當(dāng)樣品濃度為100、200 mg/L時(shí)，對SGC-7901細(xì)胞表現(xiàn)出促進(jìn)其增殖的效果。因此，蛋白質(zhì)提取物與小分子物質(zhì)、多糖成分相比對SGC-7901細(xì)胞生長抑制作用最強(qiáng)。

表1 九香蟲血淋巴三種成分作用48 h對SGC-7901細(xì)胞增殖抑制率Tab.1 The cell proliferation inhibition effects of three elements from A. Chinensis haemolymph(48 h)

注：數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。表中同一列小寫字母不同表示同一處理不同濃度下在0.05水平上差異顯著，同一行大寫字母不同表示相同濃度不同處理下在0.05水平上差異顯著。

圖2 九香蟲血淋巴三種成分作用48 h對SGC-7901細(xì)胞體外增殖影響Fig.2 The proliferation effects of three elements from A.chinensis haemolymph on SGC-7901 cells in vitro for 48 h

3 結(jié)論與討論

昆蟲是世界上最昌盛的動物類群，種類繁多，個體數(shù)量大，分布廣泛，其中藥用昆蟲作為資源昆蟲的一大類群，在中國已有3000多年的歷史[8]。迄今已有記述的藥用昆蟲隸屬于14目63科200多種，在《中國藥用動物志》中共記述了藥用昆蟲145種[9]，其中有8目14科約77個種的昆蟲可用于癌癥治療[10]。九香蟲具有廣泛的藥理活性，對胃癌、食道癌、乳腺癌、子宮頸癌和喉癌具有顯著的療效[11-12]。民間中醫(yī)常以整蟲或粗加工的九香蟲入藥治療多種疾病，國內(nèi)學(xué)者對九香蟲抗癌活性研究報(bào)道中，大多是以粗提物為作用對象進(jìn)行藥理活性研究，而并未明確具體的藥效成分。

本研究初步分離九香蟲血淋巴小分子化合物、蛋白質(zhì)及多糖三種成分并比較其對人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長的影響。九香蟲血淋巴通過截留量MWCO 3kDa的濾膜并施以膜內(nèi)外一定的壓力差，初步分離富集小分子物質(zhì)，進(jìn)一步向九香蟲血淋巴懸液中加入預(yù)冷的丙酮可使蛋白質(zhì)脫去水化層并降低介電常數(shù)，使蛋白質(zhì)容易凝聚而沉淀。通過MTT法檢測九香蟲各成分抑癌活性，各組分相同質(zhì)量體積比作用于SGC-7901細(xì)胞對其增殖影響具有顯著差異，其中蛋白質(zhì)成分活性最高，其次為小分子物質(zhì)，而多糖物質(zhì)幾乎沒有表現(xiàn)出抑癌活性。小分子化合物相比于蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)在相同的質(zhì)量濃度作用下其摩爾濃度顯著高于大分子物質(zhì)，因此進(jìn)一步反映蛋白質(zhì)的活性顯著高于小分子化合物。

蛋白質(zhì)和天然小分子化合物是昆蟲抗腫瘤藥物的主要成分。例如斑蝥素是斑蝥分泌的一種有毒的萜類化合物，斑蝥素及其衍生化合物被證實(shí)具有抑制多種體外及體內(nèi)動物模型的腫瘤細(xì)胞增殖的活性，張衛(wèi)東等[13]研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素能誘導(dǎo)人肺癌A549細(xì)胞發(fā)生凋亡，李曉飛等[14]研究發(fā)現(xiàn)斑蝥素對喉癌和胃癌細(xì)胞具有顯著的抑制作用。本研究發(fā)現(xiàn)九香蟲血淋巴中的小分子化合物也表現(xiàn)出一定的抑制胃癌細(xì)胞增殖活性，具體的藥效成分有待進(jìn)一步運(yùn)用各種層析色譜技術(shù)分離。蛋白多肽類藥物可作用于DNA，阻止基因表達(dá)，而多數(shù)活性肽通過促使細(xì)胞膜溶解，阻滯細(xì)胞分裂周期等方式誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，如蜂毒肽(Melittin，MEL)、蛾血素等。蜂毒肽是從歐洲蜜蜂(Apismellifera)毒素中提取的多肽分子，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤活性最強(qiáng)的多肽，對多種體外作用癌細(xì)胞和細(xì)菌均有明顯的殺傷效果，包括卵巢癌、乳腺癌、肝癌、白血病等[15]。九香蟲血淋巴的蛋白類成分表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制胃癌細(xì)胞增殖活性，具體的活性肽和抑癌機(jī)理有待進(jìn)一步研究。本研究初步判定九香蟲血淋巴抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的有效成分為蛋白類物質(zhì)。這一發(fā)現(xiàn)為九香蟲抗癌活性成分的分離純化提供依據(jù)，為九香蟲這一藥用昆蟲資源的開發(fā)以及抗腫瘤新藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)：

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