冷馴化草莓組培苗DNA甲基化水平及模式的變化

苗徐靜 ，文 壯 ，文曉鵬

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 農(nóng)業(yè)生物工程研究院/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新教育部實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

草莓(Fragariaananassa)具有營(yíng)養(yǎng)豐富、種植周期短、收益高等優(yōu)點(diǎn)，其屬喜溫植物，最適生長(zhǎng)溫度范圍15～30℃。但近年來(lái)全球氣溫不穩(wěn)定，冬季我國(guó)多地如浙江[1]、四川[2]出現(xiàn)寒潮以及罕見的低溫凍害，嚴(yán)重影響了冬草莓的產(chǎn)量與品質(zhì)[3]，給農(nóng)戶帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此預(yù)防低溫給草莓生長(zhǎng)造成的傷害，提升草莓的抗寒能力至關(guān)重要。怎樣提高冬草莓的抗寒性，已成為生產(chǎn)的關(guān)鍵問題之一。有研究結(jié)果表明，茶樹、椰子和草莓[4-6]等植物在通過冷馴化后抗寒性能明顯提高。植物冷馴化過程中所發(fā)生的變化是通過改變基因表達(dá)而引起的[7-8]，而植物DNA甲基化與基因表達(dá)存在關(guān)聯(lián)性，DNA發(fā)生甲基化與基因的沉默有密切關(guān)系，去甲基化則可以導(dǎo)致基因表達(dá)[9-10]。植物在逆境脅迫響應(yīng)過程中表觀遺傳起著重要作用，其中基因組DNA甲基化則是表觀遺傳的重要形式[11-13]。甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)技術(shù)是從擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(AFLP)技術(shù)改良來(lái)的，分別采用EcoR I與MspI和HpaII組合切割植物全基因組DNA。由于MspI和HpaII是對(duì)甲基化敏感的同裂酶，因此能夠識(shí)別相同的DNA序列(CCGG)，但這兩種酶對(duì)甲基化的敏感性不同，因此最終切割后產(chǎn)生的片段能夠反映出DNA序列中胞嘧啶的甲基化水平和模式。此技術(shù)是當(dāng)前研究DNA甲基化水平和模式的重要方法之一，現(xiàn)已廣泛運(yùn)用于擬南芥、草莓和西瓜[14-16]等植物上。

本文擬采用MSAP技術(shù)，探究不同冷馴化時(shí)間章姬(F.ananassa‘Akihime’)草莓基因組的DNA甲基化水平及模式的變化。以期為揭示冷馴化對(duì)草莓DNA水平變化的影響及對(duì)低溫脅迫耐受性機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)選用培養(yǎng)室繼代10次，長(zhǎng)勢(shì)一致的草莓栽培品種‘章姬’試管苗為試驗(yàn)材料。將組培苗放入4℃人工氣候箱進(jìn)行低光照(600 lx， 光照時(shí)間10 h/d)冷馴化處理，取冷馴化1 d、3 d、5 d、7 d、10 d和恢復(fù)5 d的草莓葉片，以及未進(jìn)行冷馴化處理的葉片作為對(duì)照(CK)，每個(gè)處理隨機(jī)剪去15株草莓葉片混合做DNA甲基化檢測(cè)。

1.2 基因組DNA提取

對(duì)照組和處理組群體樣本的基因組DNA，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒提取?？偤怂岬鞍诇y(cè)定儀(Kaiao， K5500)和1%的瓊脂糖凝膠電泳(120 V， 30 min)檢測(cè)基因組DNA濃度和質(zhì)量。DNA樣品在-20℃條件下儲(chǔ)存。

1.3 MSAP反應(yīng)

酶切體系：用EcoR I/HpaII和EcoR I/MspI兩組酶(Fermentas)，對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切。分兩次對(duì)DNA進(jìn)行酶切，EcoR I酶切體系(40 μL)：4 μL 10×BufferEcoR I，1 μLEcoR I(10 U/μL)，DNA模板12 μL(約600 ng)，ddH2O補(bǔ)足至40 μL，混勻后37℃酶切4 h。HpaII或MspI酶切體系(20 μL)：10 μLEcoR I酶切產(chǎn)物，0.25 μLHpaII或MspI(10 U/μL)，2 μL 10×Buffer Tango，ddH2O補(bǔ)足至20 μL，混勻后37℃酶切5～8 h。取5 μL酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，以確定酶切是否完全。連接體系(30 μL)：取酶切產(chǎn)物20 μL，加入10 pmol/μLEcoRⅠ接頭和50 pmol/μLHpaII或MspI接頭(表1)各1 μL，0.5 μL T4 DNA Ligase(5 U/μL)，3 μL 10×Ligase buffer，ddH2O補(bǔ)足至30 μL，充分混勻后22℃連接5～8 h。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)體系(30 μL)：2 μL連接產(chǎn)物，2 μL E00預(yù)擴(kuò)增引物，2 μLHM00 預(yù)擴(kuò)增引物(表5)，10 μL 2× PCR MasterMix(天根生化科技有限公司)，4 μL ddH2O，混勻。程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min，28～35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；4℃保存。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并將產(chǎn)物稀釋50倍用于選擇性擴(kuò)增模板。選擇性擴(kuò)增體系(20 μL)·3 μL預(yù)擴(kuò)增稀釋產(chǎn)物，2 μL選擇性擴(kuò)增引物EcoR I(5 μmol/L)及HpaII/MspI(5 μmol/L)(表1)，5 μL 2× PCR MasterMix，8 μL ddH2O，混合液輕輕混勻。程序：94℃預(yù)變性30 s；94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，每個(gè)循環(huán)減少0.7℃(13個(gè)循環(huán))；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2 min(25～27個(gè)循環(huán))；72℃延伸10 min；4℃保存。

加入4 μL上樣緩沖液97℃變性10 min后置于冰上，取5 μL MSAP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染方法參考梁弘偉等[17]。同一酶切位點(diǎn)條帶的有、無(wú)分別用1、0表示，對(duì)帶型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

MSAP片段分為4種類型[18]。雙酶切后的PAGE膠圖上出現(xiàn)4種甲基化形式：I型是非甲基化位點(diǎn)，表示EcoR I分別與HpaII和MpsI雙酶切后都產(chǎn)生了條帶，即(1， 1)型。II型是半甲基化位點(diǎn)，表示EcoR I與HpaII酶切后產(chǎn)生了條帶，而EcoR I與MspI酶切后沒有產(chǎn)生條帶，即(1， 0)型。III型是全甲基化位點(diǎn)，表示EcoR I和MspI酶切后沒有產(chǎn)生條帶，而EcoR I和HpaII酶切后沒有產(chǎn)生條帶，即(0， 1)。IV是超甲基化位點(diǎn)，表示EcoR I分別與HpaII和MpsI雙酶切后都沒有產(chǎn)生條帶，即(0， 0)型。

MSAP試驗(yàn)進(jìn)行了3個(gè)技術(shù)重復(fù)和生物學(xué)重復(fù)。

表1 MSAP分析的接頭和引物序列Tab.1 Sequences of adapters and primers used for MSAP analysis

1.4 甲基化位點(diǎn)回收、克隆、測(cè)序、序列比對(duì)

在MSAP試驗(yàn)完成后，切取MSAP片段(CK)，編號(hào)后放入1.5 mL的離心管內(nèi)，加80～100 μL ddH2O搖晃清洗，短暫離心后吸去ddH2O，然后加入20～30 μL TE buffer，用槍頭尖端將其搗碎，置于4℃冰箱內(nèi)過夜。次日取上清液3 μL作為擴(kuò)增模板，用相對(duì)應(yīng)的選擇性擴(kuò)增引物以及選擇性擴(kuò)增體系和條件進(jìn)行擴(kuò)增。取4 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，克隆到pEASY-T1載體中(pEASY-T1 Cloning Vector， 北京全式金生物技術(shù)有限公司)，25℃連接5～10 min。在1.5 mL離心管中，取2 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化50 μL大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，加入950 μL LB液體培養(yǎng)基，固定在搖床上(150 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)1.5～2 h)。取80～100 μL菌液涂布于含氨芐青霉素抗性的LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑出單克隆，加入5 mL LB液體培養(yǎng)基，固定在搖床上(150 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)8 h)，菌液送公司測(cè)序(生工生物工程(上海)股份有限公司)，測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSAP-PCR引物篩選

得到質(zhì)量理想的DNA后，從297對(duì)選擇性擴(kuò)增引物中篩選出條帶清晰、擴(kuò)增結(jié)果多態(tài)性高、重復(fù)性和穩(wěn)定性最好的14對(duì)引物，進(jìn)行選擇性擴(kuò)增展現(xiàn)一定的多態(tài)性(圖1)。擴(kuò)增結(jié)果表明，14對(duì)引物平均每對(duì)引物擴(kuò)增出25.5條譜帶(表2)。

2.2 冷馴化時(shí)間對(duì)DNA甲基化水平變化的影響

對(duì)不同冷馴化時(shí)間及恢復(fù)后的草莓葉片進(jìn)行甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性分析(表2)。結(jié)果得出，所有樣品中擴(kuò)增總數(shù)為2499個(gè)位點(diǎn)(圖2)，對(duì)照組與處理組從甲基化類型來(lái)看，草莓CCGG位點(diǎn)的甲基化主要是超甲基化(IV)，全甲基化(III)頻率高于半甲基化(II)。冷馴化過程中DNA總甲基化水平整體呈下降趨勢(shì)，0 d、1 d、3 d、5 d、7 d和10 d，基因組MSAP比率分別為27.17%、20.73%、25.77%、22.69%、22.69%和22.41%。去甲基化水平的最大值出現(xiàn)在低溫脅迫1 d?；謴?fù)后，DNA甲基化水平有所回升，說(shuō)明了除去低溫脅迫后，可以發(fā)生DNA甲基化形式的恢復(fù)。

注：H：EcoR I和HpaII雙酶切產(chǎn)生的條帶；M：EcoR I和MspI 雙酶切產(chǎn)生的條帶。

圖1 MASP擴(kuò)增的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)Fig.1 The result of selective PCR products detected by 6% PAGE

注：CK為對(duì)照組；1 d，3 d，5 d，7 d，10 d為低溫時(shí)間；R為恢復(fù)組。總甲基化率=[( II+ III+ IV)/( I+II+ III+ IV)]×100%。全甲基化率=[( III+ IV)/( I+II+ III+ IV)]×100%。半甲基化率=[( II)/( I+II+ III+ IV)]×100%。

2.3 冷馴化時(shí)間對(duì)DNA甲基化模式的影響

基于以上試驗(yàn)，不同冷馴化時(shí)間處理組、對(duì)照組與恢復(fù)組的胞嘧啶甲基化和去甲基化變化模式包括3種，共16種條帶類型(表3)。

模式一即甲基化位點(diǎn)無(wú)變化，此模式包含4種條帶類型(A～D)，表示在低溫處理前、后CCGG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)未變化，占80.95%～88.25%，說(shuō)明冷馴化前后材料大部分的CCGG甲基化位點(diǎn)并未改變，可以穩(wěn)定遺傳。模式二即甲基化，此模式包含6種條帶類型(E～J)，表示在冷馴化前后發(fā)生甲基化位點(diǎn)增多，占3.08%～5.60%。模式三即去甲基化，包含6種條帶類型(K～P)，表示在冷馴化前、后發(fā)生去甲基化位點(diǎn)增多，占7.56%～13.73%。在低溫處理1 d、3 d、5 d、7 d、10 d后甲基化比列分別占5.60%、3.92%、3.36%、3.08%、5.32%，去甲基化比例分別占11.20%、7.56%、9.80%、12.89%、13.73%?？傮w而言，冷馴化后章姬DNA甲基化模式去甲基化高于甲基化。

注：H：EcoR I和HpaII雙酶切產(chǎn)生的條帶; M：EcoR I和Msp I 雙酶切產(chǎn)生的條帶; CK：對(duì)照組; R：恢復(fù)組：Mater為D2000。

圖2 不同冷馴化階段MASP擴(kuò)增的聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)
Fig.2 MSAP patterns at different cold acclimation periods

2.4 DNA 甲基化位點(diǎn)分析

回收、克隆及測(cè)序部分草莓(CK)基因組DNA的甲基化位點(diǎn)，成功分離得到5條DNA序列(表4)。經(jīng)BLAST比對(duì)，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索同源序列。從表4中可以看出，回收的片段比較小，最大315 bp，最小196 bp。每條序列均屬于草莓屬，包括二氫嘧啶脫氫酶[NADP(+)](b)、L-抗壞血酸氧化酶同系物(d)以及未注釋的蛋白等，表明草莓基因組中存在豐富的甲基化修飾現(xiàn)象，可能通過調(diào)節(jié)這些功能基因的表達(dá)來(lái)響應(yīng)逆境脅迫。

高等植物基因組中“CpG” 二核苷酸是胞嘧啶殘基甲基化修飾中最主要的方式。跟據(jù)Gardiner-Garden和Frommer對(duì)“CpG island”的定義[19]，通過在線 (http：//www.ualberta.ca/～stothard/javascript/cpg_islands.html)分析，設(shè)定閾值為“CG”含量≥50%、“CpG island”長(zhǎng)度 ≥200 bp 以及“CpG”二核苷酸實(shí)際值數(shù)/期望值≥0.60，對(duì)草莓回收得到的5條甲基化修飾DNA序列中“CpG”二核苷酸分布做分析。結(jié)果表明，雖然在這5條甲基化序列中都發(fā)現(xiàn)了存在明顯的“CpG”二核苷酸成簇富集現(xiàn)象(與MSAP結(jié)果一致)，但是只得到了1個(gè)具典型“CpG island”特征的分布區(qū)域(c)，其總長(zhǎng)度為315 bp，“CG”含量為57.00%，“CpG”二核苷酸實(shí)際值數(shù)/期望值為0.82，“CpG island”長(zhǎng)度為200 bp(表5) 。

表3 不同低溫處理時(shí)間下DNA甲基化模式變化Tab.3 DNA methylation pattern at different cold acclimation periods

3 結(jié)論與討論

不改變DNA序列，卻發(fā)生基因表達(dá)的可遺傳變異便是表觀遺傳變異，主要包括 DNA 甲基化修飾、非編碼RNA 調(diào)控、組蛋白修飾等[20]。DNA 甲基化修飾是表觀遺傳變異的重要方式，植物基因組的相對(duì)穩(wěn)定以及響應(yīng)外界環(huán)境脅迫都與DNA甲基化有密切關(guān)系[21]。不同植物甲基化水平及模式會(huì)存在差異，即使是相同的植物中不同的組織或是在不同的環(huán)境下都會(huì)存在較大的差異。在許多外界環(huán)境發(fā)生改變后，比如冷、熱、鹽害、干旱、重金屬等都會(huì)導(dǎo)致DNA甲基化水平及模式發(fā)生變化[11，22]。特別是在冷脅迫下，大多數(shù)情況下總甲基化水平降低，也有少部分甲基化水平升高。DNA發(fā)生甲基化與基因沉默有關(guān)，而DNA發(fā)生去甲基化則導(dǎo)致基因表達(dá)[23]，表明不同物種在響應(yīng)外界環(huán)境脅迫時(shí)，選用不同的方式來(lái)調(diào)節(jié)自身以適應(yīng)環(huán)境改變，部分物種主要發(fā)生基因沉默，而部分物種則主要發(fā)生基因表達(dá)。其原因可能是由于物種不同導(dǎo)致的，充分反映了物種間DNA甲基化的差異性，如玉米在冷脅迫48 h下甲基化程度降低了2.2%[24]，低溫24 d解除牡丹休眠過程中甲基化程度下降了16.8%[25]，但在茶樹冷馴化過程中變化趨勢(shì)表現(xiàn)為甲基化水平增加了3.5%[26]，火龍果組培苗在低溫脅迫4 d后總甲基化水平增加了1.4%[27]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示一定程度的冷馴化使草莓的甲基化程度下降了4.76%，表明在冷馴化過程中會(huì)激起草莓基因組內(nèi)大量基因活躍表達(dá)。另有研究表明，棉花籽苗在低溫脅迫下導(dǎo)致了棉花基因組DNA甲基化水平下降，但當(dāng)?shù)蜏孛{迫除去后，甲基化水平可以發(fā)生一定程度的恢復(fù)[28]。在本研究中利用MSAP技術(shù)對(duì)草莓組培苗冷馴化及恢復(fù)后進(jìn)行甲基化檢測(cè)，結(jié)果表明，與對(duì)照相比冷馴化后基因組DNA總甲基化水平整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但在恢復(fù)后DNA甲基化水平有所回升，這與上述前人的研究結(jié)果一致。由此可以看出低溫下草莓基因組調(diào)節(jié)了某些位點(diǎn)的甲基化水平，而且這種調(diào)節(jié)可以在低溫除去后發(fā)生逆轉(zhuǎn)。有研究表明玉米[24]在低溫脅迫至24 h和48 h后甲基化水平基本穩(wěn)定在32%，本試驗(yàn)也表明在低溫脅迫延長(zhǎng)到5 d、7 d、10 d后甲基化水平基本趨于穩(wěn)定(表2)，表明了DNA甲基化水平的穩(wěn)定性對(duì)維持植物體生存也有著重要意義。試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)草莓在經(jīng)過1 d冷馴化后，其甲基化水平達(dá)到最低，與對(duì)照組比較甲基化水平下降了6.44%，分析原因可能是植物體可以通過改變DNA甲基化來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，以激活某些基因，從而幫助植物面對(duì)短暫的逆境環(huán)境。

在表觀遺傳水平上可以通過改變DNA甲基化模式來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而抵御非生物脅迫，來(lái)滿足植物的正常生長(zhǎng)[29]。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在甲基化模式變化方面，草莓產(chǎn)生了豐富的變化模式(12種)，與王小利等[30]針對(duì)高羊茅氮脅迫的試驗(yàn)中高羊茅產(chǎn)生了11種甲基化模式的變化的結(jié)果類似。雖然草莓在低溫脅迫后基因組內(nèi)存在一定數(shù)量的DNA位點(diǎn)發(fā)生甲基化模式變化，但超過80%的位點(diǎn)DNA甲基化模式與對(duì)照相比較并未發(fā)生改變，與許多前人研究結(jié)果一致[24，30]，充分表明DNA甲基化水平的穩(wěn)定性對(duì)維持植物體生存有著重要意義。

有研究表明DNA甲基化是在轉(zhuǎn)錄起始階段參與調(diào)控基因的表達(dá)，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[31]。本試驗(yàn)對(duì)部分草莓(CK)DNA甲基化位點(diǎn)回收，經(jīng)BLAST比對(duì)后，本試驗(yàn)獲得的序列與草莓屬具有較高的同源性，并且5條參考序列均為mRNA片段，獲得了二氫嘧啶脫氫[NADP(+)]、L-抗壞血酸氧化酶同系物以及未注釋的蛋白。因此可以推斷草莓基因組甲基化很可能大部分發(fā)生在編碼區(qū)域。其中抗壞血酸氧化酶廣泛存在于植物體中，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗衰老有著密切的關(guān)系[32]。有大量研究表示抗壞血酸氧化酶能夠抵御生物或非生物脅迫[33-34]。另有研究表明小麥在病情指數(shù)增加的情況下，抗壞血酸氧化酶活性提高了23.1%以上，與增強(qiáng)抗病性也有密切關(guān)系[35]。本試驗(yàn)結(jié)果表明在未進(jìn)行冷馴化之前，抗壞血酸氧化酶基因處于甲基化狀態(tài)即沉默狀態(tài)，但在經(jīng)過冷馴化之后，基因很可能被激活以抵御環(huán)境脅迫，這有待于下一步研究。

綜上，通過探究植物基因組DNA甲基化水平及模式的變化，可對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆性研究奠定一定基礎(chǔ)，可深入探究植物表觀遺傳調(diào)控的分子機(jī)理，對(duì)下一步植物育種發(fā)揮重要作用。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 徐云煥， 蔣桂華， 楊新琴， 等.大棚草莓凍害調(diào)查與防凍減災(zāi)技術(shù)措施[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2016， 57(8)：1190-1192.

[2] 陳 樂， 于 成.2016年冬草莓罕見低溫凍害及防御措施[J].四川農(nóng)業(yè)科技， 2016(6)：34-35.

[3] 沙春艷.淺談草莓低溫障礙的發(fā)生及防止措施[J].現(xiàn)代園藝， 2012(5)：55-55.

[4] 楊亞軍， 鄭雷英， 王新超.冷馴化和ABA對(duì)茶樹抗寒力及其體內(nèi)脯氨酸含量的影響[J].茶葉科學(xué)， 2004， 24(3)：177-182.

[5] 楊盛昌， 謝潮添， 張 平， 等.冷鍛煉對(duì)低溫脅迫下夏威夷椰子膜脂過氧化及保護(hù)酶活性的影響[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)， 2002， 11(4)：25-28.

[6] 張 勇， 湯浩茹， 羅 婭， 等.低溫鍛煉對(duì)草莓組培苗抗寒性及抗氧化酶活性的影響[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2008， 24(1)：325-329.

[7] Kalberer S R， Wisniewski M， Arora R.Deacclimation and reacclimation of cold-hardy plants：Current understanding and emerging concepts[J].PlantScience， 2006， 171(1)：3-16.

[8] 李 慧， 強(qiáng) 勝.植物冷馴化相關(guān)基因研究進(jìn)展[J].植物學(xué)報(bào)， 2007， 24(2)：208-217.

[9] Vanyushin B F， Kirnos M D， DNA methylation in plants[J].Gene， 1988， 74(1)117-21.

[10] Wang W， Zhao X， Pan Y，etal.DNA methylation changes detected by methylation-sensitive amplified polymorphism in two contrasting rice genotypes under salt stress[J].GenetGenomics， 38(9)：419-420.

[11] Lukens L N， Zhan S.The plant genome's methylation status and response to stress：implications for plant improvement[J].CurrentOpinioninPlantBiology， 2007， 10(3)：317-322.

[12] Karan R， Deleon T， Biradar H，etal.Salt Stress Induced Variation in DNA Methylation Pattern and Its Influence on Gene Expression in Contrasting Rice Genotypes[J].PlosOne， 2012， 7(6)：e40203.

[13] 黃韞宇， 張海軍， 邢燕霞，等.NaCl脅迫對(duì)黃瓜種子萌發(fā)的影響及DNA甲基化的MSAP分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 46(8)：1646-1656.

[14] 李照令， 王鶴潼， 陳瑞娟，等.運(yùn)用MSAP研究鎘脅迫對(duì)擬南芥幼苗基因甲基化的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 33(1)：28-36.

[15] 韓柏明， 趙 愷， 李 賀，等.組織培養(yǎng)導(dǎo)致的草莓DNA甲基化變異[J].植物生理學(xué)報(bào)， 2010， 46(8)：797-802.

[16] 楊炳艷， 霍秀愛， 劉云婷，等.低溫脅迫下西瓜同源二倍體和三倍體甲基化及基因表達(dá)的差異分析[J].園藝學(xué)報(bào)， 2014， 41(11)：2313-2322.

[17] 梁宏偉， 王長(zhǎng)忠， 李 忠，等.聚丙烯酰胺凝膠快速、高效銀染方法的建立[J].遺傳， 2008， 30(10)：1379-1382.

[18] Tang X M， Tao X， Wang Y，etal.Analysis of DNA methylation of perennial ryegrass under drought using the methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) technique[J].MolecularGenetics&GenomicsMgg， 2014， 289(6)：1075.

[19] Gardinergarden M， Frommer M.CpG Islands in vertebrate genomes[J].JournalofMolecularBiology， 1987， 196(2)：261.

[20] 王春國(guó)， 古 瑜， 陳成彬，等.不同倍性西瓜基因組DNA甲基化水平與模式的MSAP分析[J].分子細(xì)胞生物學(xué)報(bào)， 2009， 42(2)：118-126.

[21] Kinoshita T， Miura A， Choi Y，etal.One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation[J].Science， 2004， 303(5657)：521-523.

[22] 孟華兵， 杜 雪， 姜宇曉， 等.鎘脅迫下二倍體和同源四倍體油菜DNA甲基化差異分析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)， 2010， 24(6)：1297-1304.

[23] Xie G， Liu S， Tetsuo T，etal.Effects of salt and alkali stress ondifferential expression of genes in rice seedlings[J].ChineseJournalofApplied&EnvironmentalBiology， 2005， 11(2)：129-133.

[24] Shan X， Wang X， Yang G，etal.Analysis of the DNA methylation of maize ( Zea mays， L.) in response to cold stress based on methylation-sensitive amplified polymorphisms[J].JournalofPlantBiology， 2013， 56(1)：32-38.

[25] 蓋樹鵬， 張 風(fēng)， 張玉喜，等.低溫解除牡丹休眠進(jìn)程中基因組DNA甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 2012， 20(3)：261-267.

[26] 周艷華， 曹紅利， 岳 川，等.冷馴化不同階段茶樹DNA甲基化模式的變化[J].作物學(xué)報(bào)， 2015， 41(7)：1047-1055.

[27] 劉鵬飛. 離體條件對(duì)火龍果DNA甲基化變異的影響[D].貴陽(yáng)：貴州大學(xué)，2015.

[28] Hong H F， Wei J， Li T C，etal.DNA methylation alterations of upland cotton ( Gossypium hirsutum ) in response to cold stress[J].ActaPhysiologiaePlantarum， 2013， 35(8)：2445-2453.

[29] Yaish M W.DNA Methylation-Associated Epigenetic Changes in Stress Tolerance of Plants[M].Molecular Stress Physiology of Plants.SpringerIndia， 2013：427-440.

[30] 王小利， 王 茜， 舒健虹，等.氮脅迫下高羊茅基因組DNA甲基化的MSAP分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2015， 34(11)：002362-2371.

[31] 馮素彬， 鄒枚伶， 張圣奎，等.木薯干旱脅迫下甲基化變化分析[J].分子植物育種， 2017(4)：1492-1498.

[32] 郭 燕， 朱 杰， 許自成，等.植物抗壞血酸氧化酶的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2008， 24(3)：196-199.

[33] Jian-Fang H U， Gui-Fen L I， Gao Z H，etal.Regulation of Water Deficit-Induced Abscisic Acid Accumulation by Apoplastic Ascorbic Acid in Maize Seedlings[J].植物學(xué)報(bào)(英文版)， 2005， 47(11)：1335-1344.

[34] 石永春， 劉衛(wèi)群.植物中的抗壞血酸氧化酶[J].植物生理學(xué)報(bào)， 2008， 44(1)：151-154.

[35] 余澤高， 喬麗雅.小麥抗壞血酸氧化酶活性與抗病性關(guān)系的初步探討[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2003(1)：31-33.