帕瑞昔布預(yù)處理對肺缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

呂強(qiáng)，李美亭，劉宇，胡云霞(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，成都610072)

在體外循環(huán)、肺栓塞及肺移植中易發(fā)生肺缺血再灌注損傷(LIRI)。缺血再灌注時(shí)中性粒細(xì)胞在組織損傷處聚集，釋放氧自由基、細(xì)胞因子等促炎因子，引起細(xì)胞凋亡、壞死和組織損傷，最終導(dǎo)致器官功能不全。在炎癥、器官缺血再灌注損傷等多種應(yīng)激條件下，環(huán)氧化酶2(COX-2)水平升高。骨骼肌缺血再灌注引起肺損傷時(shí)，肺組織中COX-2表達(dá)增加，抑制COX-2表達(dá)可減少炎性因子生成，減輕肺損傷[1]。帕瑞昔布是臨床常用的特異性COX-2抑制劑。Zhang等[2]發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布通過抑制炎癥及氮化應(yīng)激反應(yīng)而減輕大鼠肝臟缺血再灌注損傷。血紅素加氧酶1(HO-1)為誘導(dǎo)型血紅素加氧酶。在細(xì)胞應(yīng)激過程中，HO-1活化是最重要的細(xì)胞保護(hù)機(jī)制之一。帕瑞昔布通過活性氧簇(ROS)依賴途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)HO-1[3]。有研究結(jié)果顯示，HO-1高表達(dá)可減輕LIRI及內(nèi)毒素引起的急性肺損傷[4，5]。HO-1過表達(dá)的細(xì)胞保護(hù)作用與其抗氧化功能、維持微環(huán)境穩(wěn)定、抗細(xì)胞凋亡及抗炎性反應(yīng)有關(guān)[6]。2016年8月～2017年10月，本研究擬觀察帕瑞昔布預(yù)處理對LIRI大鼠的作用，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 SPF級(jí)雄性SD大鼠32只，由四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，體質(zhì)量280～300 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將其隨機(jī)均分為4組：假手術(shù)組(S組)、缺血再灌注組(I組)、帕瑞昔布組(P組)及鋅原卟啉組(Z組)。帕瑞昔布由輝瑞中國有限公司贈(zèng)與；鋅原卟啉購于美國Sigma公司。小動(dòng)物呼吸機(jī)購于成都泰盟軟件有限公司；電子天平購于上海精密科學(xué)儀器有限公司；血?dú)夥治鰞x(i-STAT1)購于美國雅培公司；熒光定量PCR儀購于美國Bio-Rad公司；Amersham imager 600多功能成像儀購于美國GE公司。

1.2 LIRI模型制備 實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物均禁食12 h，自由飲水。腹腔注射3.6%水合氯醛1 mL/100 g進(jìn)行麻醉，取仰臥位固定。于大鼠頸部正中切口，分離氣管，切開氣管并插入氣管內(nèi)導(dǎo)管，固定后連接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，吸入室內(nèi)空氣，潮氣量8 mL/kg、呼吸頻率80次/min、吸呼比1∶2。經(jīng)右側(cè)腹股溝切口分別游離股動(dòng)、靜脈并置入24G靜脈留置針。將大鼠轉(zhuǎn)為右側(cè)臥位，取左側(cè)第5肋間逐層開胸，游離左肺門，經(jīng)股靜脈給予肝素100 U/kg。暫停機(jī)械通氣后立即用無創(chuàng)血管夾阻斷左肺動(dòng)脈、左肺靜脈和左主支氣管，用濕紗布覆蓋切口。阻斷60 min后，重新開放左肺門，并適度膨肺使左肺充分復(fù)張。繼續(xù)機(jī)械通氣120 min后，放血處死大鼠，取腫組織。S組只開胸游離左肺門，但不阻斷；I組開胸游離并阻斷左肺門；P組在阻斷左肺門前15 min經(jīng)股靜脈給予帕瑞昔布10 mg/kg；Z組在缺血前24 h經(jīng)腹腔注射鋅原卟啉20 mg/kg，其余同P組。S組、I組經(jīng)股靜脈注射等體積生理鹽水。

1.3 動(dòng)脈血?dú)夥治?分別于阻斷左肺門前5 min(T0)、再灌注后120 min(T1)時(shí)經(jīng)股動(dòng)脈采集各組血液，i-STAT1血?dú)鈨x檢測血?dú)夥治鲋笜?biāo)。記錄氧分壓(PaO2)和二氧化碳分壓(PaCO2)，并計(jì)算氧合指數(shù)(OI)、肺泡動(dòng)脈血氧分壓差(PA-aO2)。OI=PaO2/吸入氧濃度(FiO2)，PA-aO2=(大氣壓-飽和水蒸氣壓)×FiO2-PaCO2/0.8-PaO2。

1.4 肺組織濕干重比(W/D)測算 再灌注120 min后，取各組左肺上段稱量濕重，隨后置于80 ℃烘箱內(nèi)干燥48 h稱量干重，并計(jì)算W/D。

1.5 肺組織病理變化觀察 再灌注結(jié)束時(shí)，取各組左肺下段浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定3 d，石蠟包埋后切成厚度為10 μm薄片，經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.6 肺組織HO-1 mRNA表達(dá)檢測 采用RT-PCR技術(shù)。取各組左肺中段肺組織，用TRIzol試劑提取總RNA并取5 μL逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以β-actin為內(nèi)參。β-actin上游引物：5′- GAAGATCAAGATCATTGCTCCT-3′，下游引物：5′- TACTCCTGCTTGCTGATCCA-3′；HO-1上游引物：5′- CGACAGCATGTCCCAGGATT-3′，下游引物：5′- CATCACCAGCTTAAAGCCTT-3′。RT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃ 15 s，54 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.7 肺組織內(nèi)HO-1蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting法。用蛋白裂解液提取肺組織蛋白質(zhì)并測量總蛋白濃度。每孔上樣量50 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入一抗稀釋液(1∶1 000，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)，4 ℃冰箱孵育過夜，TBST液漂洗，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶10 000)，室溫下孵育1 h，滴加ECL顯影液，Amersham imager 600多功能成像儀曝光后，用Image J圖像分析軟件進(jìn)行分析，對HO-1蛋白表達(dá)豐度進(jìn)行相對定量分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血?dú)夥治鲋笜?biāo)及肺組織W/D值比較 T0時(shí)各組大鼠OI、PA-aO2比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。T1時(shí)，與S組比較，I組、P組及Z組中OI低、PA-aO2高(P均<0.05)，且I組、Z組OI、PA-aO2變化更明顯(P均<0.05)。與S組比較，其余三組W/D值高(P均<0.05)，且I組、Z組W/D值較P組高(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠OI、PA-aO2及肺組織W/D值比較

2.2 各組肺組織病理變化比較 S組肺泡結(jié)構(gòu)基本正常；I組肺泡破壞較多，肺泡壁明顯增厚，間質(zhì)水腫并伴有大量中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有水腫液聚集；P組肺泡壁仍比S組增厚，但明顯較I組減輕，且中性粒細(xì)胞浸潤較少；Z組肺組織病理改變與I組相似。

2.3 各組肺組織中HO-1表達(dá)比較 與S組比較，I組、P組及Z組HO-1 mRNA、蛋白表達(dá)高(P均<0.05)，且P組最高(P均<0.05)，I組與Z組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組肺組織中HO-1表達(dá)比較

3 討論

肺缺血時(shí)激活大量促炎因子、趨化因子和補(bǔ)體系統(tǒng)，使中性粒細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，導(dǎo)致肺組織損傷；另外，產(chǎn)生的ROS，可引起肺組織氧化損傷和細(xì)胞死亡。LIRI后，肺泡毛細(xì)血管屏障破壞，肺組織通透性增加，血漿成分滲出增多，引起肺間質(zhì)水腫和出血，導(dǎo)致?lián)Q氣功能障礙。肺組織W/D值可間接反映肺內(nèi)液體滲出程度；OI及PA-aO2可作為判斷肺換氣功能是否正常的指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LIRI后，肺組織W/D值高，OI低，PA-aO2高；給予帕瑞昔布預(yù)處理后，上述指標(biāo)均有明顯改善，肺組織病理改變也明顯減輕。表明帕瑞昔布可減輕缺血再灌注引起的肺間質(zhì)水腫和組織損傷，改善氧合功能。

在炎癥、缺血再灌注、應(yīng)激等多種情況下，細(xì)胞因子、生長因子及內(nèi)毒素等均可誘導(dǎo)COX-2表達(dá)并在組織損傷過程中發(fā)揮作用，因此，阻斷COX-2而具有抗炎特性[7]。研究顯示，在肝臟、腎臟缺血再灌注時(shí)，COX-2表達(dá)增加，抑制COX-2可減輕器官損傷[8,9]。同樣，在肺缺血再灌注時(shí)，肺組織中COX-2表達(dá)水平也明顯增加[10]。帕瑞昔布是一種特異性的COX-2抑制劑[11]。Meng等[12]在呼吸機(jī)誘導(dǎo)的肺損傷中發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布可明顯減輕局部及全身炎性反應(yīng)，從而降低肺泡上皮通透性、減輕水腫，增加OI，改善氣體交換；還可減少細(xì)胞凋亡。在肝臟缺血再灌注模型中還發(fā)現(xiàn)，帕瑞昔布可顯著抑制炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并降低誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶表達(dá)，減輕組織損傷[2]。因此，帕瑞昔布可能從多個(gè)方面減輕LIRI。

本研究結(jié)果顯示，帕瑞昔布預(yù)處理可減輕LIRI，并且增加肺內(nèi)HO-1表達(dá)；HO-1抑制劑鋅原卟啉則抵消了帕瑞昔布的肺保護(hù)作用。HO-1催化游離血紅素降解生成鐵、一氧化碳(CO)和膽綠素，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等特性。研究發(fā)現(xiàn)，HO-1表達(dá)升高可保護(hù)肺組織免遭缺血再灌注損傷[13]。HO-1的抗炎作用表現(xiàn)為減少多形核白細(xì)胞在肺內(nèi)聚集，并調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性，降低微血管通透性[14]。Kinderlerer等[15]發(fā)現(xiàn)，HO-1也可通過增強(qiáng)血管內(nèi)皮抵抗補(bǔ)體介導(dǎo)的損傷發(fā)揮肺保護(hù)作用。此外，HO-1的肺保護(hù)作用還可能與其催化代謝產(chǎn)物有關(guān)。HO-1和CO均有免疫調(diào)節(jié)作用，可調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞、樹突細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能[16]。HO-1/CO系統(tǒng)還可調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)引起的線粒體動(dòng)態(tài)失衡而減輕肺損傷[17]。CO還可增加抗凋亡蛋白表達(dá)，減少Caspase-3活化，激活應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子[18]。同樣，膽綠素也可通過抗氧化、抗炎和抗凋亡作用保護(hù)缺血再灌注肺損傷[19]。

一般認(rèn)為，COX-2抑制劑通過抑制COX-2誘導(dǎo)HO-1表達(dá)。然而，在硝普鈉介導(dǎo)的細(xì)胞毒性研究中發(fā)現(xiàn)，COX-2抑制劑誘導(dǎo)HO-1表達(dá)并不依賴于對COX-2的抑制[20]。同樣，在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，COX-2抑制劑活化PI3K/AKT途徑和線粒體氧化信號(hào)通路增強(qiáng)HO-1介導(dǎo)的抗炎活性；在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入伊諾前列腺素或前列腺素E2并不能逆轉(zhuǎn)COX-2抑制劑介導(dǎo)的HO-1表達(dá)，表明存在環(huán)氧化酶非依賴性途徑誘導(dǎo)HO-1表達(dá)[21]。因此，帕瑞昔布誘導(dǎo)缺血再灌注肺組織中HO-1表達(dá)的具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，帕瑞昔布預(yù)處理可改善大鼠LIRI后肺氧合功能，減輕肺損傷；增加缺血再灌注肺組織中HO-1表達(dá)；抑制HO-1表達(dá)則可消除帕瑞昔布的肺保護(hù)作用。因此，帕瑞昔布對LIRI的保護(hù)作用與HO-1表達(dá)升高有關(guān)。

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