血清中IGF-1及PI3K/Akt信號(hào)通路在PCOS患者體內(nèi)表達(dá)的變化及意義

李麗華

(許昌市婦幼保健院婦?？疲幽?許昌 461000)

多囊卵巢綜合癥（polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種生育年齡婦女常見的生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂綜合癥[1]。主要臨床表現(xiàn)為月經(jīng)周期不規(guī)律、不孕、多毛或痤瘡，是最常見的女性內(nèi)分泌疾病。目前PCOS的發(fā)病機(jī)制尚未明確，近年來發(fā)現(xiàn)PCOS患者存在不同程度的胰島素抵抗（insulin resistance，IR），胰島素抵抗會(huì)引起高胰島素血癥，從而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的異常增生甚至癌變[2]。體外試驗(yàn)證實(shí)，胰島素可促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，加速癌細(xì)胞進(jìn)展[3]。研究表明，卵巢胰島素抵抗的本質(zhì)是胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin－like growth factor，IGF) 分裂信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大及組織反應(yīng)性升高，導(dǎo)致胰島素受體底物（IRS）表達(dá)異常[4]，IRS通過激活P13K/AKT通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和合成代謝。P13K/AKT通路是參與體內(nèi)糖脂代謝的重要病理生理機(jī)制，激活的胰島素受體能夠通過聚集并磷酸化各種底物蛋白（IRS）而激活細(xì)胞內(nèi)的P13K/AKT通路。本研究通過檢測(cè)多囊卵巢綜合征（PCOS）患者IGF-1、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶 B（Akt）的表達(dá)及意義，旨在為PCOS的診治提供臨床依據(jù)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月至2017年2月在河南省許昌市婦幼保健院治療的PCOS患者100例，其中不存在胰島素抵抗（IR）患者57例（A組），存在IR患者43例（B組），納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴診斷符合2003年歐洲人類生殖和胚胎學(xué)會(huì)和美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)制定的標(biāo)準(zhǔn)[4]；⑵患者及家屬知情同意并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴近3個(gè)月使用過激素類藥物；⑵合并有甲狀腺功能異常、腎上腺疾病等其他內(nèi)分泌疾病。同時(shí)選取非PCOS患者60例作為對(duì)照組 （因輸卵管因素不孕經(jīng)前或卵巢良性腫瘤術(shù)前行診刮術(shù)者）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）、IGF-1含量測(cè)定 患者過夜禁食10h后，在次日清晨8時(shí)抽取靜脈血2ml，3500r/min離心15min，分離上層血清置于-20℃冰箱待測(cè)。使用葡萄糖氧化酶法測(cè)定患者空腹血糖（FBG）水平，使用ELISA法測(cè)定空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)水平并計(jì)算 HOMA-IR，計(jì) 算 公 式 ：HOMA-IR=FINS×（FBG/22.5）。 使 用ELISA方法測(cè)定人血清IGF-1含量，試劑盒購自Sigma-aldrich公司。所有操作步驟均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 標(biāo)本采集和PI3K-Akt通路表達(dá)檢測(cè) 患者在月經(jīng)來潮后的12h以內(nèi)采集子宮前后壁的新鮮內(nèi)膜組織，取得組織存放于無菌凍存管后移至-80℃冰箱保存待用，行Western Blotting檢測(cè)。

Western Blotting檢測(cè)主要步驟：冰浴條件下使用細(xì)胞裂解液提取子宮內(nèi)膜的總蛋白，BCA方法測(cè)定總蛋白的濃度，自動(dòng)酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)。制備分離膠，濃度為10%。上樣取既定樣品蛋白質(zhì)50μg。積層膠所加電壓為80V，SDS-PAGE采用10%分離膠恒壓120V分離目的蛋白；恒流300mA轉(zhuǎn)膜1h；含5%脫脂奶粉的TBST溶液4℃封閉過夜；孵育一抗，1×TBST室溫下洗膜三次，一抗稀釋比例為1：1000（Akt、p-Akt兔源單克隆抗體購自美國(guó)CST公司），4℃搖床過夜；孵育二抗，1×TBST室溫下洗膜三次，二抗稀釋比例為1：5000，搖床室溫下孵育1h（HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，美國(guó)Zymed Laboratories）。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒發(fā)光顯影。膠片經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)掃描成像、分析，以各指標(biāo)與內(nèi)參照的比值表示其相對(duì)表達(dá)水平。兔抗人PI3K﹑內(nèi)參照為β肌動(dòng)蛋白(β-actin)兔源多克隆抗體，均購自美國(guó)Abcam公司。所有操作按照說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。相關(guān)分析采用Pearson分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組年齡、血清IGF-1水平比較 三組受試者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A組和B組患者 IGF-1、HOMA-IR、FBG和 FINS明顯高于對(duì)照組 （P＜0.05）；B 組患者 IGF-1、HOMA-IR、FBG和FINS明顯高于A組（P＜0.05）。見表1。

2.2 三組子宮內(nèi)膜PI3K、Akt及p-Akt表達(dá)比較A組和B組患者子宮內(nèi)膜PI3K、Akt和p-Akt明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；B組患者子宮內(nèi)膜PI3K、Akt和 p-Akt明顯高于 A 組 （P＜0.05）。 見圖 1，表2。

2.3 相關(guān)性分析 將 PCOS患者 IGF-1、PI3K、Akt和p-Akt表達(dá)量與HOMA-IR進(jìn)行Pearson相關(guān)分析， 結(jié)果顯示：PCOS患者 IGF-1、PI3K、Akt和 p-Akt表達(dá)量與 HOMA－IR 呈正相關(guān)（r=0.321、0.336、0.401 和 0.366，P＜0.05）。見表 3。

表1 三組年齡、血清IGF-1、HOMA-IR、FBG及FINS水平比較（±s）

表1 三組年齡、血清IGF-1、HOMA-IR、FBG及FINS水平比較（±s）

注：a表示與對(duì)照組比較P＜0.05；b表示與A組比較P＜0.05。

組別 例數(shù)A組B組對(duì)照組57 43 60 F P年齡（歲） IGF-1（ng/ml） FBG（mmol/L） FINS(mU/L) HOMA-IR 30.01±4.38 29.64±3.20 30.12±5.22 2.044 0.103 432.28±87.39a 489.01±90.44ab 281.04±75.29 64.291＜0.001 6.14±1.43a 7.55±1.50ab 5.41±0.89 23.104＜0.001 7.35±1.16a 12.60±1.26ab 4.99±0.94 30.573＜0.001 2.04±0.84a 3.91±0.91ab 1.20±0.74 42.011＜0.001

表2 三組血清PI3K、AKT及p-Akt表達(dá)量比較（±s）

表2 三組血清PI3K、AKT及p-Akt表達(dá)量比較（±s）

注：a 表示與對(duì)照組比較P＜0.05；b 表示與 A 組比較P＜0.05。

0.7 1 3±0.1 2 3 a 1.1 0 1±0.1 1 2 ab 0.4 0 6±0.1 0 3 2 0.0 6 3＜0.0 0 1組別A組B組對(duì)照組例數(shù)4 3 5 7 6 0 F P P I 3 K表達(dá)量 A k t表達(dá)量 p－A k t表達(dá)量0.8 9 1±0.1 1 2 a 1.1 0 2±0.1 8 1 ab 0.5 4 1±0.1 0 4 2 2.0 3 3＜0.0 0 1 0.8 1 2±0.1 2 0 a 1.2 0 4±0.2 4 ab 0.4 2 2±0.1 0 1 2 5.2 8 1＜0.0 0 1

圖1 Western blot檢測(cè)圖

表3 IGF-1、PI3K、Akt和p-Akt表達(dá)量與HOMA-IR相關(guān)分析結(jié)果

3 討論

多囊卵巢綜合癥（polycystic ovarian syndrome，PCOS)是一種生殖功能障礙與糖代謝異常并存的內(nèi)分泌紊亂綜合癥，是生育期婦女月經(jīng)紊亂最常見的病因[5]。POCS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，其病理生理過程涉及了機(jī)體包括糖代謝、脂肪代謝、蛋白質(zhì)代謝等多種代謝途徑異常[6]。其中糖代謝異常主要表現(xiàn)為胰島素抵抗，導(dǎo)致PCOS患者代償性高胰島素血癥。Arduc等[7]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者普遍存在不同程度的IR，同時(shí)當(dāng)IR伴有高胰島素血癥時(shí)，會(huì)大大增加子宮內(nèi)膜增生甚至癌變的幾率。本研究結(jié)果顯示，PCOS患者HOMA－IR明顯高于正常人（P＜0.05），同時(shí)存在 IR 的 PCOS 患者 HOMA－IR明顯高于不存在 IR 的 PCOS 患者（P＜0.05），這與以上報(bào)道結(jié)果相符。

胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF－1）是一種在分子結(jié)構(gòu)上與胰島素類似的多肽類蛋白物質(zhì)[8]。IGF－1主要在肝臟中合成與表達(dá)，它可以促進(jìn)機(jī)體有絲分裂，參與機(jī)體的新陳代謝等多種代謝途徑。本實(shí)驗(yàn)中PCOS患者的血清IGF－1濃度高于正常人，并且存在IR的PCOS患者的血清IGF－1濃度高于不存在 IR 的 PCOS 患者（P＜0.05），提示 IGF－1 參與了PCOS的發(fā)病過程，并且與IR存在一定關(guān)系。其機(jī)制可能為，IGF－1促進(jìn)卵巢雄激素的生物合成。PCOS病人因IGF－1的過度作用，引起卵泡膜聞質(zhì)細(xì)胞的LH受體增加，卵巢對(duì)于黃體生成素的敏感度增加導(dǎo)致卵泡募集，抑制優(yōu)勢(shì)卵泡的發(fā)育，促進(jìn)了卵泡的閉鎖[9]。Brazert M等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PCOS患者IGF－1水平明顯高于正常人。高胰島素血癥可抑制肝臟合成胰島素生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白 (IGFBP－1)，游離的IGF－1增多導(dǎo)致機(jī)體的高胰島素環(huán)境，進(jìn)一步加劇IR，促進(jìn)多囊卵巢形成。陳巍等[11]發(fā)現(xiàn)IGF－1在PCOS大鼠模型中呈高表達(dá)，其檢測(cè)對(duì)人類PCOS的診斷及發(fā)病機(jī)制研究具有重要參考價(jià)值。這也提示可以從阻斷IGF－1的作用入手來開辟一種新的PCOS治療途徑。

PI3K/AKT通路在腫瘤和炎性反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[12]。有研究報(bào)道，在骨肉瘤、卵巢上皮癌及腎腫瘤等多種惡性腫瘤中都發(fā)現(xiàn)有PI3K/Akt的過度表達(dá)[13]。由于胰島素主要通過PI3K/Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)代謝，而大多數(shù)PCOS患者存在IR，會(huì)導(dǎo)致PI3K－AKT信號(hào)通路功能失調(diào)。PCOS患者子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)的Akt過度磷酸化可以導(dǎo)致子宮內(nèi)膜上皮不典型增生，He H[14]等研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增生和子宮內(nèi)膜自身穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PCOS患者子宮內(nèi)膜p－Akt表達(dá)比正常子宮內(nèi)膜患者水平升高，存在IR患者子宮內(nèi)膜組織中p－Akt蛋白的表達(dá)水平明顯高于不存在胰島素抵抗（IR）患者。提示胰島素P13K/Akt信號(hào)通路的過度活化，即p－Akt的過度表達(dá)參與了PCOS的發(fā)生和發(fā)展過程。通過相關(guān)性分析，PCOS患者 IGF－1、PI3K和 Akt表達(dá)量與HOMA－IR呈正相關(guān)。表明PCOS患者血清IGF－1、子宮內(nèi)膜中PI3K和Akt水平明顯升高，可能與PCOS患者胰島素抵抗有一定的關(guān)系，值得進(jìn)一步研究。C Palladino等[15]研究顯示，胰島素抵抗的PCOS中，PI3K/Akt信號(hào)通路過度的表達(dá)是PCOS患者子宮內(nèi)膜過度增生和發(fā)生癌變的基礎(chǔ)。本結(jié)果中，PCOS患者的血清IGF-1濃度也高于正常人，因此分析PCOS患者PI3K/Akt的原因可能為，PCOS患者大多存在IR和高胰島素血癥，導(dǎo)致子宮內(nèi)膜組織增生，加之高胰島素血癥的刺激，IGF與細(xì)胞膜上胰島素及胰島素樣生長(zhǎng)因子受體結(jié)合，受到激活的受體會(huì)導(dǎo)致胰島素受體底物的酪氨酸殘基磷酸化，從而激活細(xì)胞內(nèi)的PI3K/AKT/GSK3通路。

綜上所述，PCOS患者血清IGF-1、子宮內(nèi)膜中PI3K和、Akt和 p-Akt水平明顯升高，可能與PCOS患者胰島素抵抗有一定的關(guān)系，PI3K-Akt信號(hào)通路的研究不僅能幫助了解PCOS的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也有望開辟治療PCOS的新途徑，值得進(jìn)一步研究。

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