降鈣素原量子點(diǎn)熒光免疫層析檢測(cè)法的方法學(xué)評(píng)價(jià)

鐘陽(yáng)青，陳銳，張偉龍，潘理想，陳杰，林燕珍

(東莞市塘廈醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東 東莞 523722)

降鈣素原（PCT）是一種內(nèi)源性非類固醇抗炎物質(zhì)，是降鈣素的前體，在甲狀腺中合成，在細(xì)菌感染時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生，目前被認(rèn)為在調(diào)控細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著舉足輕重的作用[1]。PCT是全身感染、局部感染及預(yù)后判斷的良好指標(biāo)[2－4]。用于PCT檢測(cè)的方法主要有免疫層析法[5]免疫比濁法[6]、上轉(zhuǎn)熒光法、膠體金比色法、乳膠增強(qiáng)免疫比濁法、電化學(xué)發(fā)光法[7]和免疫色譜檢測(cè)法。量子點(diǎn)(Quantum dots，QDs)，屬于新型半導(dǎo)體納米材料，具有優(yōu)良的光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性。與生物熒光染料相比，其激發(fā)譜線范圍寬、發(fā)射譜線窄、發(fā)光效率高、發(fā)光顏色可調(diào)、光穩(wěn)定性好，十分適合作為熒光標(biāo)記物[8]。本研究通過(guò)對(duì)量子點(diǎn)熒光免疫層析法的精密度、分析測(cè)量范圍、生物參考區(qū)間及與梅里埃miniVIDAS熒光免疫法的比對(duì)試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)其方法學(xué)性能，現(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料與方法

1.1 材料 梅里埃miniVIDAS免疫熒光檢測(cè)系統(tǒng)（參比系統(tǒng)），深圳金準(zhǔn)生物量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)系統(tǒng)（實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)），配套的校準(zhǔn)品、質(zhì)控品，接近廠家聲明分析上、下限的新鮮血清標(biāo)本，收集2017年5月至2017年6月東莞市塘廈醫(yī)院檢測(cè)的患者新鮮血清120例，其檢測(cè)結(jié)果分布廠家說(shuō)明的整個(gè)分析測(cè)量范圍。

1.2 方法 精密度評(píng)價(jià)采用EP15－A3方案，即使用參比系統(tǒng)配套的兩個(gè)濃度水平的質(zhì)控品在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上每天檢測(cè)一批，每批重復(fù)測(cè)試5次，連續(xù)測(cè)試5d，通過(guò)統(tǒng)計(jì)計(jì)算重復(fù)性精密度和期間精密度；分析測(cè)量范圍評(píng)價(jià)采用EP6－A2方案，即選擇接近說(shuō)明書(shū)分析測(cè)量上限（H）和下限（L）的標(biāo)本，按照5H、4H+L、3H+2L、2H+3L、H+4L、5L 的比例混合，上機(jī)檢測(cè)，每一份混合樣品檢測(cè)兩次，以理論值為縱坐標(biāo)、實(shí)測(cè)值為橫坐標(biāo)，計(jì)算斜率、截距和線性相關(guān)系數(shù)；生物參考區(qū)間驗(yàn)證采用C28－A2方案，選取于體檢科體檢的健康個(gè)體血清20例，上機(jī)檢測(cè)，所有20例標(biāo)本中有大于95%的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果小于0.25ng/ml為可接受；對(duì)比實(shí)驗(yàn)用新鮮血清2h內(nèi)分別在參比系統(tǒng)和實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)上進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 儀器試劑 梅里埃公司miniVIDAS分析儀；深圳金準(zhǔn)生物有限公司PCT測(cè)定試劑盒；所有儀器均使用配套試劑，嚴(yán)格按照廠家要求進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)，各檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)期間質(zhì)控均在控。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集完成后錄入excel表格，采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以參比系統(tǒng)結(jié)果為準(zhǔn)，以 0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.0ng/ml為臨界值，計(jì)算實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的陽(yáng)性符合率、陰性符合率、假陽(yáng)性率、假陰性率、診斷符合率，率的比較使用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；通過(guò)Kappa分析法分析三種檢測(cè)方法的一致性，K值大于0.75為一致性較好，K 值在 0.4～0.75 之間表示一致性一般，kappa＜0.4 為一致性較差。

2 結(jié)果

2.1 精密度評(píng)價(jià)結(jié)果 在2.01ng/ml濃度水平時(shí)重復(fù)性精密度 CV為 4.96%，期間精密度 CV為6.81%， 在 20.13ng/ml濃度水平時(shí)重復(fù)性精密度CV為4.70%，期間精密度CV為9.68%。 見(jiàn)表1。

表1 精密度評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2 分析測(cè)量范圍評(píng)價(jià)結(jié)果 采用EP6－A2文件的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)分析，低值標(biāo)本測(cè)定均值為0.1327ng/ml，高值標(biāo)本均值為 93.2917ng/ml，通過(guò)線性回歸分析后斜率 a=0.978， 截距 b=－0.741，線性相關(guān)系數(shù) r=0.996， 斜率 a 在 0.97～1.03 之間，線性相關(guān)系數(shù) r＞0.975， 檢測(cè)系統(tǒng)在 0.1327ng/ml～93.2917ng/ml濃度范圍內(nèi)呈線性。

2.3 診斷效能評(píng)價(jià)結(jié)果 以參比系統(tǒng)為準(zhǔn)分別取0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.0ng/ml為臨界值， 統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的陽(yáng)性符合率、陰性符合率、假陽(yáng)性率、假陰性率、診斷符合率，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

2.4 生物參考區(qū)間驗(yàn)證 選取的20份健康體檢者的血清標(biāo)本PCT檢測(cè)結(jié)果均小于0.25ng/ml；

2.5 與參比系統(tǒng)結(jié)果一致性分析 當(dāng)K值＞0.75時(shí)表示一致性較好，介于0.4～0.75之間時(shí)一致性一般，當(dāng)K值＜0.4時(shí)表明兩種方法的一致性較差。以0.25ng/ml為臨界值時(shí) K 值為 0.73， 以 0.5ng/ml為臨界值時(shí)K值為0.81，以2.0為臨界值時(shí)K值為0.95。

2.5 與參比系統(tǒng)結(jié)果的相關(guān)性分析 選取的120份標(biāo)本濃度范圍在 0.05ng/ml到 59.88ng/ml之間，在2h內(nèi)完成兩檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)。結(jié)果通過(guò)線性回歸分析得出斜率 a 為 0.865，截距 b 為 0.294，相關(guān)系數(shù)R2為0.982，相關(guān)性較好。

表2 不同臨界值下的檢測(cè)結(jié)果（例數(shù)）

表3 不同cut-off值下量子點(diǎn)免疫熒光層析法的診斷效能（%）

圖1 參比系統(tǒng)與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性分析

3 討論

血清降鈣素原（PCT）是反應(yīng)全身炎癥狀況的生物標(biāo)志物，具有實(shí)時(shí)、便捷、敏感、特異等優(yōu)點(diǎn)，隨著研究的深入、檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，大量研究表明以 0.25ng/ml、0.5ng/ml、2.0ng/ml為臨界值其在 AECOPD、濃度血癥等的輔助診斷、預(yù)后判斷和指導(dǎo)抗生素使用方面有重要的意義[9－11]。因此對(duì)PCT的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度和靈敏度要求較高。

量子點(diǎn)(Quantum dots，QDs)，屬于新型半導(dǎo)體納米材料，具有優(yōu)良的光譜特征和光化學(xué)穩(wěn)定性。與生物熒光染料相比，其激發(fā)譜線范圍寬、發(fā)射譜線窄、發(fā)光效率高、發(fā)光顏色可調(diào)、光穩(wěn)定性好，十分適合作為熒光標(biāo)記物[8]。何國(guó)煒[12]等的研究表明量子點(diǎn)熒光免疫層析法檢測(cè)PCT的性能與Roche電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)的檢測(cè)性能有很好的相關(guān)性。余皓[13]等的研究也表明量子點(diǎn)技術(shù)與其它免疫定量檢測(cè)具有較好的可比性。

本研究采用EP15－A3文件[14]方案對(duì)量子點(diǎn)熒光免疫層析法（試驗(yàn)系統(tǒng)）進(jìn)行精密度評(píng)價(jià)，結(jié)果在 2.01ng/ml和 20.13ng/ml濃度時(shí)其重復(fù)性變異系數(shù)（CV）分別為 4.96%、4.70%，期間變異系數(shù)（CV）分別為6.81%，9.68%，廠家說(shuō)明書(shū)給出批內(nèi)CV＜15%，批間CV＜20%，驗(yàn)證結(jié)果符合廠家說(shuō)明，根據(jù)國(guó)家衛(wèi)生與計(jì)生委員會(huì)臨床檢驗(yàn)中心室間比對(duì)允許總誤差為30%，重復(fù)性CV小于1/4允許總誤差，期間精密度小于1/3允許總誤差，表明其精密度符合要求。分析測(cè)量范圍評(píng)價(jià)采用EP6－A2文件[15]方案進(jìn)行，結(jié)果在廠家聲明的整個(gè)線性范圍內(nèi)結(jié)果呈線性；選取的20例健康個(gè)體的血清標(biāo)本其PCT檢測(cè)結(jié)果均小于 0.25ng/ml；

實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)與參比系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)果比較在以0.5ng/ml和 2.0ng/ml為臨界值時(shí)兩種方法的診斷符合率分別為90.83%、98.33%，一致性較好K值分別為 0.81 和 0.95，但是在以 0.25ng/ml為臨界值時(shí)一致性一般K值為0.73，存在著25%的假陽(yáng)性率，但是其陽(yáng)性符合率達(dá)98.333%，總的診斷符合率達(dá)86.67%，故符合臨床檢測(cè)的需要。

隨著檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步和臨床研究的深入，PCT檢測(cè)在全身感染和局部感染的診斷和鑒別診斷、治療方案選擇、預(yù)后判斷等方面起重要作用[16]。本研究表明三種檢測(cè)系統(tǒng)間比較各有優(yōu)劣，檢測(cè)結(jié)果兩兩比較相關(guān)性均較好，但是結(jié)果數(shù)值差異較大，因此實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)同一病人的標(biāo)本需要固定檢測(cè)系統(tǒng)，或進(jìn)行檢測(cè)系統(tǒng)之間的相關(guān)性轉(zhuǎn)換，保證科室結(jié)果的一致性。

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