測定白酒中揮發(fā)性風味成分方法的研究

吳衛(wèi)宇 ，蘇占元 ，楊曉軍 ，張宿義 ，秦 輝 ，趙金松 ，3，4

（1.國家酒類及加工食品質量監(jiān)督檢驗中心瀘州實驗室，四川瀘州646000；2.瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000；3.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，四川瀘州646000；4.四川理工學院，四川自貢643000）

白酒的主要成分是酒精和水，占總量的98%～99%，但決定白酒質量和風格的卻是微量（占總量的1%～2%）的呈香呈味有機化合物及其量比關系[1]。白酒中呈香呈味有機化合物主要包括多元醇、有機酸、酯類、高級醇、醛類、芳香族化合物及雜環(huán)類化合物[2-4]。據報道，江淮流域單糧型酒中重要風味化合物有22種，從劍南春酒中檢測出重要風味化合物21種，從五糧液酒中檢測出重要風味化合物25種，這些重要風味物質相輔相成，使?jié)庀阈桶拙频摹跋?、味、格、體”協(xié)調統(tǒng)一[5]。

目前富集濃縮白酒中揮發(fā)性風味成分的前處理方法有直接進樣、液液萃取、固相萃取、頂空固相微萃取及攪拌棒吸附萃取[6-9]等方法，用于分析檢測白酒中揮發(fā)性風味成分的儀器主要有GC、GC-O、GC-MS及GC×GC-TOFMS[10-13]。

氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜儀（GC/Q-TOFMS）是在飛行管和檢測器之前使用六級桿碰撞池執(zhí)行MS/MS，被色譜柱分離的樣品首先通過電子轟擊EI離子源進行電離，電離之后，離子將通過四級桿質量分析器，質量分析器包括4根平行雙曲面桿，通過這4根平行雙曲面桿，可以根據選定離子的質荷比（m/z）來過濾這些離子。通過四級桿的離子隨后被引導至碰撞池，該碰撞池設置為選擇和碎裂前級離子以形成產物離子，這些離子通過切片器傳送，到達飛行管末端時，它們將從反射器或雙極離子鏡彈開，朝相反的路徑向下回到飛行管底部。模數(shù)檢測器位于飛行管的底部，它將計算離子的數(shù)量并將信號發(fā)送到特定軟件以進行數(shù)據收集和分析。故而，氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜儀（GC/Q-TOFMS）具有高的分離能力、質量準確度、掃描速度、靈敏度及4～5個數(shù)量級的動態(tài)范圍，可滿足白酒中痕量級揮發(fā)性風味成分的檢測[14]。本實驗采用直接進樣結合氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜儀（GC/Q-TOFMS）建立了一種測定白酒中79種主要揮發(fā)性風味成分的方法，該方法具有較高的準確度和靈敏度，能夠滿足白酒中主要揮發(fā)性風味成分的測定。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售白酒樣品。

儀器設備：7890B/7200Q-TOF氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜儀，美國安捷倫科技公司；超純水處理系統(tǒng)，美國密理博公司；電子天平（220 g,0.1 mg），賽多利斯科學儀器有限公司；移液槍（0～100 μL及100～1000 μL），大龍醫(yī)療設備（上海）有限公司。

標準品（色譜純，純度≥99.9%）：甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、異丁酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、肉豆蔻酸乙酯、亞油酸乙酯、月桂酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸、月桂酸、苯甲酸、苯丙酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、乙醛、正丙醛、異丁醛、乙縮醛、異戊醛、己醛、糠醛、苯甲醛、2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二酮、甲醇、2-丁醇、正丙醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、己醇、庚醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、糠醇、β-苯乙醇、吡啶、2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、四甲基吡嗪、愈創(chuàng)木酚、2-甲基苯酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對甲酚、3-甲基苯酚、4-乙基苯酚：西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司。

內標物（色譜純，純度≥99.9%）：叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸，天津市津科精細化工研究所。

水：符合GB/T 6682—2008規(guī)定的一級水，本實驗室自制。

溶劑：無水乙醇（色譜純）及加水配制為60%vol的乙醇溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 GC-MS條件

色譜柱：VF-WAXms（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純He（99.999%）；流速1 mL/min；進樣模式：分流進樣，分流比 20∶1；進樣量：1 μL；載氣：20.0 mL/min；進樣口溫度：250℃；程序升溫：初始溫度35℃保持10 min，以2℃/min升溫至120℃，再以5℃/min升溫至200℃，再以10℃/min升溫至245℃，保持40 min；GC/Q-TOFMS接口溫度：280℃；EI離子源；電離能量：70 eV；離子源溫度：230℃，四級桿溫度：150℃；質量掃描范圍m/z：29～500。

1.2.2 內標溶液的制備

準確稱量叔戊醇、乙酸正戊酯、2-乙基丁酸置于200 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為內標溶液，3種內標的濃度分別為15.19 g/L、15.10 g/L、15.09 g/L。

1.2.3 標準溶液的制備

混標1#：準確稱取甲酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、丙酸乙酯、丁酸乙酯、異丁酸乙酯、戊酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、丁二酸二乙酯、苯甲酸乙酯置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為78.1 mg/L、1612.5 mg/L、70.1mg/L、878mg/L、614mg/L、80.9mg/L、1136.5mg/L、64.8 mg/L、711 mg/L、608 mg/L、4610 mg/L、710 mg/L、2427.5 mg/L、639 mg/L、715 mg/L、79.3 mg/L。

混標2#：準確稱取月桂酸乙酯、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯置于50 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為88.4 mg/L、612 mg/L、310 mg/L、75.2 mg/L、736 mg/L。

混標3#：準確稱取乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、己酸、庚酸、辛酸、壬酸置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為2272 mg/L、432 mg/L、589 mg/L、597 mg/L、930 mg/L、579 mg/L、1443 mg/L、686 mg/L、658 mg/L、623 mg/L。

混標4#：準確稱取月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、苯甲酸、苯丙酸、亞油酸置于100 mL容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為286 mg/L、134 mg/L、365 mg/L、184 mg/L、189 mg/L、137 mg/L、64.3 mg/L、376 mg/L。

混標5#：準確稱取乙醛、正丙醛、異丁醛、異戊醛、己醛、糠醛、苯甲醛、乙縮醛置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為761 mg/L、313 mg/L、78.2 mg/L、385 mg/L、378 mg/L、761 mg/L、260 mg/L、1069 mg/L。

混標6#：準確稱取2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2,3-丁二酮、3-羥基-2-丁酮置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為426 mg/L、53.8mg/L、438 mg/L、280 mg/L、129 mg/L。

混標7#：準確稱取甲醇、正丙醇、2-丁醇、異丁醇、正丁醇、異戊醇、正戊醇、正己醇、正庚醇、2,3-丁二醇、1,2-丙二醇、糠醇、β-苯乙醇置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為860 mg/L、997 mg/L、283 mg/L、334 mg/L、292 mg/L、412 mg/L、308 mg/L、309 mg/L、285 mg/L、332 mg/L、347 mg/L、298 mg/L、416 mg/L。

混標8#：準確稱取2-甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、三甲基吡嗪、2,3-二乙基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪、四甲基吡嗪、吡啶置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為232 mg/L、314 mg/L、298 mg/L、302 mg/L、399 mg/L、82 mg/L、387 mg/L。

混標9#：準確稱取苯酚、3-甲基苯酚、2-甲基苯酚、4-乙基苯酚、對甲酚、愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚置于100 mL容量瓶中，用體積分數(shù)為60%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備液。該標準儲備液中各組分的濃度分別為141.2 mg/L、379 mg/L、404mg/L、110.7mg/L、584mg/L、500mg/L、419mg/L。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理方法的選擇

液液萃取方法操作簡單、回收率高，但有機溶劑用量大，萃取濃縮過程中也會損失一部分易揮發(fā)性成分[15]。固相微萃取技術是在固相萃取技術基礎上發(fā)展起來的一種集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體的無溶劑樣品萃取技術，該技術與固相萃取技術相比操作更簡單、攜帶更方便并且克服了固相萃取回收率低、易堵塞孔道的缺點，但該技術需要配套的固相微萃取操作平臺及萃取頭，價格昂貴，不利于大批量處理樣品[16]。攪拌棒吸附萃取技術是一種新型的固相微萃取樣品前處理技術，具有固定相體積大、萃取容量高、無需外加攪拌子、可避免競爭性吸附、能在自身攪拌的同時實現(xiàn)萃取富集等優(yōu)點，但同樣具有價格昂貴不利于大批量處理樣品的缺點[15]。本實驗是針對大批量用于指導釀酒生產、酒體設計等工作的樣品，故而選擇直接進樣法，該方法操作簡單，無需有機溶劑，避免樣品處理中微量成分的損失，具有簡單快速、重現(xiàn)性好、檢測準確度高并且成本消耗低等優(yōu)點。

2.2 色譜柱的選擇[10]

白酒色譜分析所用的毛細管柱通常都是極性柱，常見的有 DB-WAX、HP-INNOWAX、HPFFAP、DB-WAXFF及近幾年剛剛上市的VFWAXms柱。本實驗通過測試發(fā)現(xiàn)HP-FFAP柱無法將乙酸乙酯及乙縮醛分離開；HP-INNOWAX柱乙酸乙酯和乙縮醛、丁酸乙酯和正丙醇分離度不好；DB-WAX柱基本能把白酒中的揮發(fā)性風味成分分離開，但是酸類成分的峰形不佳；VF-WAXms柱能把白酒中的揮發(fā)性風味成分分離，并且峰形尖銳便于準確定量，故本實驗優(yōu)選色譜柱VF-WAXms（60 m×0.25 mm×0.25 μm）測定白酒中79種揮發(fā)性風味成分。

2.3 進樣量和分流比的選擇

進樣量過大，容易造成柱子過載損害柱子的固定相液膜；進樣量過小，使檢測器響應信號降低不易檢測出揮發(fā)性風味成分。因此，進樣量和分流比對于組分的分離、儀器的響應有很大影響，進而影響定量的準確性[17]。本實驗通過測試發(fā)現(xiàn)，當選用進樣量1 μL、分流比20∶1時，79種組分得到了較好的分離，檢測器響應較好，定量各種物質的線性關系較好。

2.4 升溫程序的選擇

對于含有多種微量成分的白酒樣品，常常需要用程序升溫分離，因為在恒溫條件下，如果柱溫較低，則低沸點組分分離較好，而高沸點組分的流出時間會太長，造成峰展寬，甚至滯留在色譜柱中造成柱污染；反之，當柱溫太高時，低沸點組分又難以分離[18]。故而，本實驗采用程序升溫并且是多階程序升溫，升溫速率較慢，可以較好的分離79種揮發(fā)性風味成分。

2.5 質譜定性定量

分別取混標1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9# 稀釋液加內標，按照1.2.1條件進行全掃描，得到混標1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#的總離子流色譜圖分別見圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9。并利用NIST2012標準圖譜庫進行檢索，確定每種物質的保留時間和特征離子碎片，選擇豐度相對較高的離子作為定性離子，把豐度較高并且與相鄰峰之間無干擾的離子作為定量離子，質譜條件見表1。在相同條件下進行標樣測定，采用峰面積比與質量濃度比的內標法結合標準曲線法定量分析。

2.6 方法線性范圍

分別取混標 1#、2#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、9#，用體積分數(shù)為60%的乙醇溶液稀釋成5個梯度混合標樣，分別移取5 mL到比色管中，并加入0.1 mL的內標溶液，搖勻，上機測定。以混標中各組分對應內標的峰面積比值為縱坐標，以混標中各組分與對應內標含量比值為橫坐標，計算得到79種物質的回歸線性方程和相關系數(shù)R2，結果見表2。

從表2可以看出，79種成分在上述條件下分析檢測時，在各自濃度范圍內具有很好的線性關系，相關系數(shù)R2≥0.99，能夠滿足白酒中主要揮發(fā)性風味物質的檢測。

圖1 混標1#總離子流色譜圖

圖2 混標2#總離子流色譜圖

圖3 混標3#總離子流色譜圖

圖4 混標4#總離子流色譜圖

圖5 混標5#總離子流色譜圖

圖6 混標6#總離子流色譜圖

圖7 混標7#總離子流色譜圖

圖8 混標8#總離子流色譜圖

圖9 混標9#總離子流色譜圖

2.7 方法檢出限、精密度和回收率

檢出限和定量限主要是考察方法的靈敏度；而回收率主要是考察所建方法的準確度。本實驗利用無水乙醇和水配制成不含這79種揮發(fā)性風味成分的60%vol白酒代用樣，量取5 mL，分別添加3個濃度梯度D1（5 mL標準儲備液）、D2（10 mL標準儲備液）、D3（15 mL標準儲備液），用60%vol的無水乙醇定容至25 mL，分別移取5 mL到比色管中，并加入0.1 mL的內標溶液，搖勻，每個濃度水平平行測試6次。利用上述水平進行添加回收率試驗，平均回收率和相對標準偏差（RSD，n=6）結果見表3。并利用添加D1（5 mL標準儲備液）的濃度水平為依據，3倍信噪比計算檢出限，10信噪比計算定量限，計算結果見表3。

由表3可知，各成分平均回收率為95.67%～106.32%，RSD為1.20%～4.21%，方法檢出限為0.027～1.69 mg/L，定量限為0.081～5.07 mg/L。能夠滿足白酒中主要揮發(fā)性風味物質的檢測，用于指導酒廠生產實踐及酒體設計工作。

3 結論

采用直接進樣技術結合氣相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質譜儀（GC/Q-TOFMS）建立了一種測定白酒中79種主要揮發(fā)性風味成分的方法。在選定的色譜條件下，79種物質得到了較好的分離，在各自濃度范圍內具有很好的線性關系，相關系數(shù)R2≥0.99，方法回收率在95.67%～106.32%，方法檢出限和定量限分別為0.027～1.69 mg/L和0.081～5.07 mg/L。該方法具有較高的準確度和靈敏度，能夠滿足白酒中主要揮發(fā)性風味物質的測定。

表1 79種揮發(fā)性風味成分保留時間、定性和定量離子

續(xù)表1 79種揮發(fā)性風味成分保留時間、定性和定量離子

表2 79種揮發(fā)性風味成分工作標準曲線

續(xù)表2 79種揮發(fā)性風味成分工作標準曲線

續(xù)表3 79種揮發(fā)性風味成分方法檢出限、精密度和回收率(n=6)

[1] 沈怡方.白酒生產技術全書[M].北京：中國輕工業(yè)出版社,1998：762-779.

[2]張衛(wèi)衛(wèi),劉建學,韓四海,等.白酒基酒典型風味物質含量的測定方法與差異性研究[J].食品科學,2015(24)：122-126.

[3]康文懷,徐巖.中國白酒風味分析及其影響機制的研究[J].北京工商大學學報：自然科學版,2012,30(3)：53-58.

[4]傅國城.中國白酒香型劃定背景與主流發(fā)展趨勢的探討[J].釀酒,2010,37(1)：97-99.

[5]徐巖,范文來,王海燕,等.風味分析定向中國白酒技術研究的進展[J].釀酒科技,2010(11)：73-78.

[6]蔡心堯,尹建軍,胡國棟.毛細管柱直接進樣法測定白酒香味組分的研究[J].色譜,1997,15(5)：367-371.

[7]張五九,何松貴,韓興林,等.豉香型白酒風味成分分析研究[J].釀酒科技,2010(12)：58-64.

[8]馮俊旗.河南六種白酒香氣成分的分析與構成規(guī)律研究[D].新鄉(xiāng)：河南科技學院,2013.

[9]徐占成,陳勇,王雙.利用全二維氣質聯(lián)用技術和吸附攪拌萃取技術對中國名酒劍南春酒體風味質量特色的研究[J].釀酒,2012,39(5)：6-8.

[10]吳衛(wèi)宇.毛細管色譜法測定白酒中多種微量成分[J].釀酒科技,2011(5)：108-109.

[11] 徐占成,王雙,徐姿靜,等.色譜聞香技術GC/O在蒸餾酒中的應用[J].釀酒科技,2011(6)：42-44.

[12] 李俊剛,郭文宇,羅英,等.利用GC-MS法對不同窖齡下濃香型白酒風味物質的研究[J].中國釀造,2015,34(9)：141-144.

[13]季克良,郭坤亮,朱書奎,等.全二維氣相色譜/飛行時間質譜用于白酒微量成分的分析[J].釀酒科技,2007(3)：100-102.

[14]Agilent Technologies.Agilent7200精確質量四級桿飛行時間GC/MS系統(tǒng)概念指南大圖景[M].Santa Clara:Agilent Technologies,2009.

[15]張琪,徐勇,沈才洪,等.濃香型白酒揮發(fā)性風味成分分析研究進展[J].釀酒科技,2017(12)：98-104.

[16]謝建春.現(xiàn)代香味分析技術及應用[M].北京：中國標準出版社,2008：96.

[17]劉坤.氣相色譜法測定白酒中的主要成分[J].河北化工,2012,35(3)：58-60.

[18]王宇成.最新色譜分析檢測方法及應用技術實用手冊[M].吉林：吉林省出版發(fā)行集團,2004(11)：693-701.