基于多元統(tǒng)計(jì)分析的3種法定基源黃精化學(xué)成分比較研究

楊興鑫 董金材 胡海波 王鑫 畢倩 李鳳嬌 魏佳迪 梁麗 王曦 顧雯 俞捷

摘要：目的 比較研究《中華人民共和國藥典》規(guī)定的3種基源黃精的化學(xué)成分差異。方法 利用超聲法提取收集到的17批黃精藥材，提取液經(jīng)PS/AL固相萃取小柱凈化后，采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC-Orbitrap MS）技術(shù)分別對其化學(xué)成分進(jìn)行表征，并用多元統(tǒng)計(jì)分析處理數(shù)據(jù)，包括主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、正交校正的偏最小二乘分析（OPLS-DA）及聚類分析（HCA）。結(jié)果 從正、負(fù)離子模式下的PCA、PLS-DA、OPLS-DA散點(diǎn)圖及HCA樹狀圖可見，3種法定基源黃精明顯聚為3類。結(jié)論 3種基源黃精的化學(xué)成分存在明顯差異，所建立的分析方法可用于區(qū)分3種法定基源黃精。本研究結(jié)果可為黃精藥材的深入研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：黃精；多花黃精；滇黃精；化學(xué)成分；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；比較研究；多元統(tǒng)計(jì)分析

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.05.016

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）05-0071-06

Comparative Study on Chemical Constituents in Three Official Materials of

Polygonati Rhizoma by Using Multivariate Statistical Analysis

YANG Xing-xin1，2， DONG Jin-cai1，2， HU Hai-bo3， WANG Xin4， BI Qian1，2， LI Feng-jiao1，2，

WEI Jia-di1，2， LIANG Li1，2， WANG Xi1，2， GU Wen1，2， YU Jie1，2

1. College of Pharmaceutical Science， Yunnan University of Traditional Chinese Medicine， Kunming 650500， China； 2. Kunming Key Laboratory for Metabolic Diseases Prevention and Treatment by Chinese Medicine， Kunming 650500， China； 3. College of Pharmaceutical Science， Gannan Medical University， Ganzhou 341000， China；

4. Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Beijing 100026， China

Abstract： Objective To comparatively study the chemical constituents of the three official materials of Polygonati Rhizoma recorded in the Chinese Pharmacopoeia. Methods The 17 batches of medicinal materials were extracted by ultrasonic method. The extracts were purified by PS/AL column of solid phase extraction， and then analyzed by ultra-high performance liquid chromatography tandem electrostatic field orbital trap high-resolution mass spectrometry （UPLC-Orbitrap MS） to profile their chemical constituents. After that， the obtained data were treated by using multivariate statistical analysis， including principal component analysis （PCA）， partial least squares discriminant analysis （PLS-DA）， orthogonal partial least squares discriminant analysis （OPLS-DA） and hierarchical cluster analysis （HCA）. Results Three official materials of Polygonati Rhizoma clearly clustered as three classes， which were showed in the PCA， PLS-DA and OPLS-DA scatter plots and HCA dendrogram under both positive and negative ion mode. Conclusion There is significant discrepancy in the chemical constituents of the three official materials of Polygonati Rhizoma， and the analytical methods can be used to distinguish the three official medicinal materials. The results will provide basis for the further investigation and scientific development of quality standards of Polygonati Rhizoma.

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81660596、81460623、81760733）；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目[2017FF117-（013）、2016FD050、2014FA035、2014FZ083]；云南省中青年學(xué)術(shù)和技術(shù)帶頭人后備人才（2015HB053）；云南省高校南藥研究協(xié)同創(chuàng)新中心（30270100500）

通訊作者：俞捷，E-mail：cz.yujie@gmail.com

Keywords： Polygonati Rhizoma； Polygonatum cyrtonema Hua； Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl； chemical constituents； ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry； comparative study； multivariate statistical analysis

黃精具補(bǔ)腎益精、滋陰潤燥之功，用于滋補(bǔ)強(qiáng)身和治療腎虛精虧、肺虛燥咳以及脾胃虛弱之證[1]，是中醫(yī)臨床常用藥物之一。現(xiàn)代藥理研究表明，黃精具有增強(qiáng)免疫、降低血脂、血糖、延緩衰老等多種藥理作用[2]，是重要的藥食兩用資源。

2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定，黃精來源于百合科植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricum Red.或多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua的干燥根莖。根據(jù)形狀不同，分別習(xí)稱“大黃精”“雞頭黃精”“姜形黃精”[1]。3種法定基源黃精在我國分布較廣，蘊(yùn)藏量較大。其中，黃精分布于東北、華北、西北、華東以及河南、湖北、四川、貴州；多花黃精分布于華東、中南及四川、貴州等地；滇黃精主產(chǎn)云南，四川、貴州、廣西等省區(qū)也有分布[3-4]。

黃精主要含有多糖、甾體皂苷、三萜皂苷、黃酮、蒽醌、生物堿、木脂素、氨基酸等成分[5]，其中甾體皂苷、三萜皂苷、黃酮為黃精屬植物的特征性成分，甾體皂苷和多糖在黃精中含量較高且通常認(rèn)為是其主要活性成分。盡管目前已建立了黃精這一植物品種的HPLC指紋圖譜[6]及浙江產(chǎn)黃精藥材酸水解物的HPLC指紋圖譜[7]，且有報(bào)道不同產(chǎn)地的黃精植物中薯蕷皂苷元含量差異較大[6]，然而，《中華人民共和國藥典》收載的3種法定基源黃精的化學(xué)成分是否存在差異尚未見報(bào)道。另外，在藥材市場上，市售黃精類藥材多為片狀，難以采用性狀鑒別、顯微等方法區(qū)分、鑒定不同品種藥材。為此，本研究采用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UPLC- Orbitrap MS）技術(shù)對收集的17批次不同基源黃精藥材的化學(xué)成分進(jìn)行表征分析，并利用主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）、正交校正的偏最小二乘分析（OPLS-DA）及聚類分析（HCA）4種多元統(tǒng)計(jì)分析方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，探討不同基源黃精化學(xué)成分的差異性，為黃精藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)，并為進(jìn)一步的藥效評價(jià)、資源開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Ultimate 3000超高效液相色譜串聯(lián)Q Exactive四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技公司，美國），配有CBM-20A系統(tǒng)控制器、LC-20AD四元泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-20A柱溫箱及SPD-M20A PDA檢測器；14-1275超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DK-S24電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；N-11000-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海愛朗儀器有限公司）；萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；HR/16M高速冷凍離心機(jī)（湖南赫西儀器裝備有限公司）；MILLI-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

PS/AL固相萃取小柱（天津博納艾杰爾科技公司）；色譜級乙腈、色譜級甲醇（德國Merk公司）；超純水由MILLI-Q超純水系統(tǒng)制備；其余試劑均為分析純。

17批黃精藥材（見表1），其中1～8批經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院俞捷副教授鑒定為百合科黃精屬植物滇黃精Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.，9～11批與12～17批經(jīng)贛南醫(yī)學(xué)院胡海波老師鑒定分別為百合科黃精屬植物多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua.和百合科黃精屬植物黃精Polygonatum sibiricum Red.，憑證標(biāo)本均保存于昆明市代謝性疾病中醫(yī)藥防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

將黃精藥材放入50 ℃烘箱烘干至恒重，粉碎，過40目篩。精密稱取粉末5 g置錐形瓶中，加入70%乙醇40 mL，搖勻，超聲提?。?00 W，40 kHz）30 min，放冷，抽濾，收集濾液，濾渣及濾紙一并轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加70%乙醇40 mL，超聲30 min提取第2次，放冷，抽濾，收集濾液，合并2次濾液，減壓回收溶劑（50 ℃），浸膏用70%甲醇5 mL復(fù)溶。取PS/AL固相萃取小柱，用20 mL甲醇活化，20 mL水洗滌，再將5 mL樣品溶液倒入固相萃取小柱中，用20 mL純水淋洗，25 mL甲醇洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑（50 ℃），用70%甲醇復(fù)溶并定容至5 mL。0.22 ?m濾膜過濾后得供試品溶液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分析條件

2.2.1 超高液相色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0 min，10%A；20 min，25%A；30 min，35%A；40 min，50%A；50 min，65%A；60 min，85%A；70 min，100%A；75 min，100%A）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：10 ?L。